病理制片中微小病变组织的优化和改进

王守梅，朱诗琦，周 睿，朱美琪，方 媛，张树辉

在日常病理操作和制片过程中经常会发现微小病变组织，一类是送检组织较小，如内窥镜活检组织；另一类是送检组织较大，但病变区域特别小，有的仅有几毫米，甚至仅有几团细胞。面对如此微小的病变组织，在经过取材、脱水、包埋、切片及进一步检测时如何尽可能多地保留病变组织，作者结合自身经验和学习探讨，现就如何保证微小病变组织的制片质量谈几点体会。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器随机选取2018年5月～2019年5月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院病理科存档的微小病变组织标本，对照组与实验组各50例；贝索苏木精染色液；贝索伊红染色液；Leica ASP300全自动脱水机、Leica EG1150石蜡包埋机、Leica RM2235石蜡切片机，Leica ST5020全自动染色机、Leica CV5030封片机、Leica Bond Max全自动免疫组化仪。

1.2 方法微小病变组织标本对照组按照正常流程操作，实验组经以下几方面进行优化和改进，其余过程两组相同。组织脱水和包埋后3～5 μm厚连续切片，后经过漂片、烤片，在全自动染封一体机中进行染色和封片制作HE切片或制作白片进行进一步免疫组化检测和其它检测项目。

1.2.1取材操作 接收到10%中性缓冲福尔马林固定的标本后的第一关卡便是取材，标本信息核对准确无误后，如果发现组织很小或病变区域很小时，首先可以将组织用伊红做标记后包入纱布或滤纸中防止标本由于过小而失落[1]，其次在包埋盒中加入“少修条”以提醒工作人员在后续包埋时提高注意，最后初步判断如需做进一步检测时直接在申请单上标注出，在常规切片时直接切出相应的白片以备用。

1.2.2包埋操作 包埋时可以先在包埋模具中注入一半量熔化的蜡液，然后将包埋模具置于冷台上，用镊子将组织转移到包埋模具中[2]。在包埋过程中查见带有少修条的包埋盒时应当特别注意，仔细观察微小病变组织的包埋面，否则制作出来的切片会观察不到组织的全层结构，难以作出正确诊断。包埋大块组织中的微小病变区域时，要注意包埋面的平整，防止修片时修掉病变区域。包埋结束时将少修条放在包埋框上方的液体石蜡上，待石蜡凝固后少修条则会紧紧嵌入石蜡中(图1)。

图1 包埋时将少修条放在包埋框上方 图2 在多张待检白片上标上序号，按序号漂片并做相应检测项目

1.2.3切片操作 在切片过程中发现带有少修条的蜡块时应当特别注意，仔细观察微小病变区域的位置，切片时要用力均匀，少粗修多细修，随时注意病变组织的暴露情况，一旦病变组织暴露，尽量原位原切，不更换新的刀口防止刀口间有距离差并避免新刀口静电吸附。切片3～4 μm厚为佳，切忌边切片边调整厚度。

1.2.4加做检测操作 在诊断过程中由于病变部分太小，大大增加了诊断的难度，有时候需加做免疫组化等指标来辅助诊断。对于微小病变区域，有时候连续切片的同一蜡片条带上，第一个蜡片与最后一个蜡片上的病变细胞数量差异较大。将需要做的检测项目按照重要程度进行排序，最重要的指标放在首位，同时相应的在切片上标注序号，将第一个蜡片放在第一张切片上做排序中的第一个检测项目(图2)，将连续切片的最后一张行HE染色以确认病变细胞多少。

1.3 染色HE染色：常规制作HE切片后，在70 ℃烘片机上烤片15 min，全自动染封一体机(Leica ST5020全自动染色机和Leica CV5030封片机)进行HE染色和封片：二甲苯10 min×3次、100%乙醇1 min、95%乙醇1 min、75%乙醇1 min、流水冲洗1 min、苏木精8 min、分化液20 s、流水冲洗3 min、蓝化液1 min、流水冲洗3 min、伊红1 min、75%乙醇1 min、95%乙醇1 min、100%乙醇1 min×2次、二甲苯5 min×3次，封片后结束HE染色程序。免疫组化染色：将编号后的白片与医师开据的重要检测项目的序号一一对应后使用Leica Bond Max全自动免疫组化仪进行染色，机器设置程序：加热抗原修复20 min，冷却至室温，PBS漂洗，3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶活性，加一抗20 min，Post Primary 10 min，Polymer 10 min，DAB显色10 min，苏木精复染，水洗后将玻片从机器中取出，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 优化和改进操作后制作HE切片及免疫组化切片的检测结果对比HE染色切片及免疫组化染色切片由两名高级别病理医师镜下阅片进行诊断及制片质量打分。HE切片质量及免疫组化切片质量评分根据病变区域情况进行评分：不能满足诊断需求为1分，基本满足诊断需求为2分，较好满足诊断需求为3分，非常满足诊断需求为4分。

1.5 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，恶性组织检出率的比较采用χ2检验，检验水平α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE切片质量微小病变组织经优化和改进操作后，内窥镜组织无遗漏现象，包埋组织集中，HE切片的切面较为完整，镜下见组织结构和细胞形态清晰，实验组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 HE切片质量实验组与对照组相比

2.2 免疫组化切片质量微小病变组织蜡片越往后切病变组织越少，经编号后切白片制作免疫组化切片，这样就可以保证最前面的蜡片能进行有诊断意义的检测项目，免疫组化切片质量评分，实验组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。微小病变区域可较好地呈现在多张免疫组化片上，镜下见组织结构和染色定位清晰准确，能较好地满足诊断需求(图3)。

表2 免疫组化切片质量实验组与对照组相比

图3 微小病变组织按序号进行HE染色(A)和CK7(B)、CK19(C)、CK20(D)免疫组化检测

3 讨论

病变组织过小、诊断者缺乏相应临床经验、取材和制片困难时，易发生漏诊[3]。为了使小组织更醒目、更易识别，我们先将组织用伊红滴染后包入纱布或滤纸中，随后放入加了伊红的10%中性缓冲福尔马林中固定进行浸染以减少伊红褪色，日常操作中不同单位的改进方法也不尽相同，有的单位使用苏木精对小组织进行染色固定也取得了良好的效果[4]。微小病变组织的制片难度较大，我们要谨防丢失医师诊断的关键依据。一般常规制片过程中3～5 μm厚切片，也就是说没有完全相同的2张切片，包括连续切片时相邻的2个蜡片。尤其在微小病变组织中，连续切片的蜡条上面第一个蜡片与最后一个蜡片上的病变细胞数量差异很大，这时最大程度地保证重要诊断项目就是我们首要的任务。经过长期的实践，作者发现编号制片可以很好地满足诊断需求。

在病理操作流程及制片过程中要非常小心，因为每一环节均很重要，均可能影响到最终的制片质量[5]。对待小组织，无论临床医师有无提醒注意，技术人员均要加倍注意，要有高度的责任心和严谨的工作态度，对病理操作流程的各个环节有充分的认识和掌握，在日常工作中谨慎再谨慎，不断地思考、总结和改进，提高制片质量，最大可能地保证医师诊断的关键依据。