前列腺癌组织中TEM8与VEGF的表达及临床意义

李明凤，方林娜，计 翼，胡沛然，孙 林，王悦晨，孙礼洁，尹 玉,3

前列腺癌是我国男性泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)是前列腺癌检测、诊断、分级和预测预后的重要生物学标志物，但其不具有前列腺癌的特异性且无法区分惰性疾病和侵袭性疾病[1]。因此，寻找新的特异的生物学标志物，并探讨其是否可以作为治疗靶点，对明确病理诊断及患者的治疗均具有重要意义。肿瘤血管内皮标志物8(tumor endothelial marker 8, TEM8)在多种肿瘤细胞和肿瘤相关细胞(如肿瘤内皮细胞、周细胞和癌成纤维细胞)中表达上调，在肿瘤细胞的迁移、黏附和肿瘤血管生成等生理过程中发挥重要作用[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为血管生成的主要调节因子，能够特异性地作用于血管内皮细胞，在肿瘤细胞的快速生长和转移中发挥重要作用。本实验采用免疫组化MaxVision法检测前列腺癌组织和前列腺增生组织中TEM8和VEGF蛋白表达，探讨两者表达的相关性及临床意义，旨在为前列腺癌的治疗寻找新靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2015～2017年安徽医科大学第一附属医院存档的行前列腺穿刺活检、前列腺癌电切术、前列腺癌根治术的前列腺组织标本94例。标本均经病理医师明确诊断，均有详细的临床病理资料，且患者术前均未行任何治疗。94例标本中前列腺癌标本71例，患者年龄47～88岁，平均69.03岁；前列腺增生组织标本23例，患者年龄59～81岁，平均69.43岁。采用美国癌症联合委员会(AJCC)分类法对前列腺癌组织进行TNM临床分期，并采用与预后密切相关的五级法进行Gleason评分，即对同一组织不同区域腺癌结构的变异，按照主要和次要分化程度分别评分，最终以两项评分相加的总分划分前列腺癌组织为中+高分化腺癌组(Gleason评分≤7)和低+未分化癌组(Gleason评分>7)。实验中选取的23例前列腺增生标本作为前列腺癌标本的对照组。

1.2 试剂TEM8鼠单克隆抗体(1 ∶20，NOVUS，200C1339)、VEGF鼠单克隆抗体(1 ∶100，Abcam公司，ab1316)以及购自北京中杉金桥公司的通用型酶标山羊抗鼠/兔聚合物、PBS缓冲液粉剂、柠檬酸盐抗原修复液、DAB酶底物显色试剂盒以及免疫组化试剂盒。

1.3 方法免疫组化染色采用MaxVision法。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋后连续4～5 μm厚切片。组织标本经烤片、梯度乙醇脱水、抗原修复以及过氧化物酶阻断等一系列处理后，滴加一抗，4 ℃过夜孵育。HRP辣根酶标记的二抗室温下孵育。实验中以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照。

1.4 结果判读将免疫组化切片置于光镜下观察，以免疫显色强度和阳性细胞密度作为定量评分标准进行判读。TEM8阳性定位于前列腺癌和前列腺增生组织中腺上皮细胞的胞质和胞膜(图1)，VEGF阳性定位于前列腺癌和前列腺增生组织中腺上皮细胞的胞质。观察待检测组织相应部位出现弥漫均质的淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒以及褐黄色粗颗粒的程度，无细胞着色为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；结合TEM8、VEGF染色阳性细胞密度进行评分，阳性细胞数≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。参照文献[3-4]，以两项评分的乘积作为最终的判断结果，≤7分为阴性组，>7分为阳性组。

1.5 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行χ2检验和Spearman等级相关分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织和前列腺增生组织中TEM8、VEGF的表达TEM8在前列腺癌组织中的阳性率为60.6%(43/71)(图1)，在前列腺增生组织中的阳性率为21.7%(5/23)，两者差异有统计学意义(χ2=10.479，P<0.05)；VEGF在前列腺癌组织中的阳性率为59.2%(42/71)，在前列腺增生组织中的阳性率为13%(3/23)，两者差异有统计学意义(χ2=13.120，P<0.05，表1，图2)。值得注意的是，20例转移性前列腺癌组织中TEM8的阳性率为85%(17/20)，51例非转移性前列腺癌组织中TEM8的阳性率为51.0%(26/51)，差异有统计学意义(P<0.05)；转移性前列腺癌组织中VEGF的阳性率为80%(16/20)，非转移性前列腺癌组织中VEGF的阳性率为51.0%(26/51)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1 前列腺增生及前列腺癌组织中TEM8和VEGF的表达

表2 非转移性前列腺癌及转移性前列腺癌组织中TEM8和VEGF的表达

图1 TEM8免疫组化结果判读：A.前列腺癌细胞无着色为0分；B.弱阳性为1分；C.中等阳性为2分；D.强阳性为3分，MaxVision法 图2 A.TEM8在前列腺增生组织中呈阴性，MaxVision法；B.TEM8在前列腺癌组织中呈阳性，MaxVision法；C.VEGF在前列腺增生组织中呈阴性，MaxVision法；D.VEGF在前列腺癌组织中呈阳性，MaxVision法

2.2 TEM8、VEGF表达与前列腺癌临床病理特征的关系TEM8高表达与前列腺癌组织的Gleason评分、TNM分期以及骨转移相关(P<0.05)，与患者年龄、术前PSA水平无关(P>0.05)。VEGF的高表达与前列腺癌组织的TNM分期以及骨转移相关(P<0.05)，与患者年龄、术前PSA水平和Gleason评分无关(P>0.05，表3)。

表3 TEM8、VEGF表达与前列腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 前列腺癌组织中TEM8与VEGF表达的相关性前列腺癌组织中TEM8和VEGF同时阳性33例，同时阴性19例；两者之间呈显著正相关(rs=0.443，P<0.001，表4)。

表4 前列腺癌组织中TEM8与VEGF表达的相关性

3 讨论

前列腺恶性肿瘤的治疗方法通常有内分泌治疗、手术治疗、放化疗。手术切除和内分泌治疗可使早期前列腺癌患者出现短期症状的缓解，不幸的是，疾病在一段时间后可能进展为恶性程度更高的难治性前列腺癌，放、化疗对肿瘤细胞选择性差且具有难以避免的副作用，这些均使前列腺癌的治疗受阻。Folkman[5]提出肿瘤血管新生理论，认为肿瘤生长到一定程度时，肿瘤的持续生长取决于其是否有充足的血液供应，抗肿瘤血管新生理论的提出为癌症诊疗提供新方向。肿瘤脉管系统为肿瘤的快速增殖和转移提供了充足的血液供应，同时也为肿瘤细胞逃逸提供了转移的路径，TEM8和VEGF作为抗肿瘤血管生成的候选分子，已被发现在多种肿瘤细胞中存在过表达趋势[6]。

TEM8是整合素样细胞表面跨膜蛋白，最初因其在结直肠肿瘤内皮细胞中高表达而被鉴定出来，随后TEM8被发现是炭疽毒素的受体，介导炭疽毒素进入细胞[7]。TEM8特异性地表达于肿瘤内皮细胞和癌细胞中，提示TEM8作为肿瘤治疗靶点具有潜在的优势。TEM8基因敲除小鼠实验证明，敲除TEM8基因后，小鼠正常的生长发育及伤口的愈合均未受到影响，但其体内出现大量细胞外基质沉积，提示TEM8在维持细胞外基质稳态方面发挥作用[2]。在裸鼠移植瘤模型中，靶向TEM8的特异性抗体能够同时靶向三阴型乳腺癌干细胞和肿瘤相关血管系统，诱导瘤体消退[8]。研究表明，在婴幼儿血管瘤中TEM8与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)在功能上相互作用并参与对下游VEGF信号通路的调控[9]。TEM8的高表达已被发现与乳腺癌、结肠癌和骨肉瘤等疾病的不良预后水平相关[7,10]。尽管如此，TEM8的生理功能尚不十分清楚，有待进一步研究证实。

VEGF又称血管通透因子，定位于人类染色体6p21，由2个相同多肽链通过二聚体聚合而成，具有促进内皮细胞有丝分裂和抗凋亡的作用。VEGF可诱导肺腺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞的迁移和侵袭[11]。除此之外，VEGF通过信号转导诱导血管瘤内皮细胞的增殖，在婴幼儿血管瘤的发展中起重要作用。靶向VEGF/VEGFR2轴的治疗药物已在临床上用于多种癌症的治疗(如结肠癌、肺癌、脑癌、肾癌等)[12]。文献报道[13-14]，从健康对照组、局限性前列腺癌组到转移性前列腺癌组，血浆VEGF水平逐渐升高且VEGF的表达与前列腺癌患者生存期密切相关。因此，抗VEGF治疗已成为前列腺癌多项临床试验的目标。VEGF是肿瘤血管新生所必需的因子，其在正常血管生成过程中亦可发挥作用，在肿瘤微环境中的VEGF表达受多种因素的调节(如低氧环境、雄激素水平等)。TEM8的高表达亦可诱导肿瘤组织的血管新生，但相比于VEGF，TEM8基因敲除的动物模型表明其并非正常生理状态所必需的因子，这种特异性表达于肿瘤细胞和肿瘤脉管系统的能力使得TEM8更具治疗的潜力。TEM8、VEGF促进前列腺癌进展的分子机制及两者是否存在相关信号通路仍有待研究和证实。

本实验通过检测TEM8、VEGF在不同分期和分级的前列腺癌组织中的差异性表达，试图探讨两者在前列腺癌中的临床病理学意义。结果显示，TEM8、VEGF的表达与前列腺癌组织的TNM分期以及骨转移密切相关，由此推断TEM8、VEGF可能在前列腺癌的发展和转移中发挥作用。TEM8和VEGF的表达有明显的相关性，提示两者可能在前列腺癌的发生、发展中发挥协同作用。因此，TEM8、VEGF有望成为前列腺癌靶向治疗的新靶点。