传统发酵豆酱中乳酸菌的分离及鉴定

左丽丽，高永欣，王钰涓，王舒然，富校轶

(吉林医药学院 公共卫生学院，吉林 吉林 132013)

豆酱是我国古老且具有特色的传统发酵调味品，距今已经有数千年的发展历史。传统发酵豆酱的制作方法是以黄豆为主要的原材料，首先经过煮制，然后挤压成块，再通过制曲以及发酵等一系列的工艺加工而成的半流动态食品[1]。在传统豆酱的制曲以及豆酱的发酵过程中，利用原材料以及周围环境中存在的各种微生物通过自然发酵，微生物将原材料中的大分子物质例如蛋白质、脂肪、碳水化合物等进行分解，得到小分子的酸、醛、酮和酯等一系列风味物质，从而使传统发酵豆酱的pH值以及各种营养成分等发生一系列的变化[2,3]。发酵豆酱中因为含有丰富的营养成分、浓郁的香气和色泽以及独特的味道，深受全国各地居民的喜爱。同时发酵豆酱中还蕴藏着丰富的且有益于机体健康的微生物资源，例如乳酸菌、酵母菌等。大量研究成果表明，乳酸菌在豆酱的自然发酵过程中发挥非常重要的作用，能够直接影响豆酱的色、香、味等，是与其风味的形成关系最为密切的细菌[4,5]。目前，国内外专家以及学者对各种各样发酵食品中存在的不同乳酸菌进行了大量的研究工作，然而，对吉林地区农家传统发酵豆酱中天然存在的乳酸菌种类及其分布的研究甚少。

因此，本文以吉林市农家传统发酵大酱为试材，在豆酱自然发酵过程中，采用倾注法对不同发酵周期的豆酱进行乳酸菌疑似菌株的分离和纯化，通过生理学鉴定，并对不同周期分离出的乳酸菌提取DNA，进行PCR扩增，通过测序分析不同发酵周期大酱中乳酸菌的种类，为进一步研究、开发利用东北传统发酵豆酱中丰富多样的乳酸菌资源，改善豆酱的风味和品质，同时扩大工业化生产规模，提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

农家大酱：采用东北传统方法自制发酵而成，分别在发酵后1～10周每周取样一次，共采集10次，样品采集方式为随机采样。样品采集后，将其分装到10 mL灭菌离心管中，于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 培养基与试剂的配制

MRS培养基配方：葡萄糖20.0 g/L，牛肉浸膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，琼脂18 g，临用前添加2% CaCO3，于121 ℃高压灭菌20 min。

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(50次)，采购于生工生物工程(上海)股份有限公司；细菌通用引物27f和1495r(引物序列：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2×Taq PCR Master Mix试剂(试剂中含有染料)，购于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 仪器与设备

GI54DWS立式高压蒸汽灭菌锅 致微(厦门)仪器有限公司；明澈D24UV超纯水处理系统 Millipore(密理博)公司；HZL-F100恒温恒湿振荡培养箱 太仓市强乐实验设备有限公司；5430R型高速冷冻离心机、6331 PCR仪 德国Eppendorf公司；FE20K pH计 Mettler-Toledo公司；1645050电泳仪、ChemiDoc XRS凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司；JNOEC XS-212-201生物显微镜 日本Olympus工业有限公司。

1.4 样品的采集

在传统豆酱发酵过程中，从发酵的1～10周每周定时采集不同时期的豆酱样品各50 g，将其分装于10 mL灭菌离心管中，同时记录发酵过程以及时间等相关信息，运回实验室保存至-80 ℃超低温冰箱备用。

1.5 乳酸菌的分离纯化

采用倾注培养法同时结合划线分离的方法，对不同发酵时期传统发酵豆酱中的乳酸菌进行分离和纯化。分别称取1～10周各个采样阶段的豆酱样品1 g，用灭菌的生理盐水进行10倍、100倍梯度稀释后，分别吸取10-1～10-2的样品稀释液各20 μL于培养皿中，将121 ℃ 20 min灭菌的MRS培养基冷却至50～60 ℃之间，向其中加入2 mL制霉菌素溶液，使培养基中制霉菌素的质量浓度达到90 μg/mL，目的是防止霉菌和酵母菌的生长和繁殖。然后将MRS培养基倒入培养皿，与豆酱样品稀释液混合均匀，待培养基凝固后，将其倒置在30 ℃恒温培养箱中培养48～72 h[6-8]。

1.6 乳酸菌的形态观察以及生理学鉴定

观察平板内细菌的生长情况，挑取有溶钙圈并且直径在1～2 mm的单菌落，反复划线分离，纯化至单菌落为止。

将分离得到的产酸菌进行过氧化氢实验，并将过氧化氢酶结果呈阴性的菌株逐一进行形态学鉴定。同时观察MRS培养基平板上所分离得到的乳酸菌菌落形态、大小、光泽、边缘形状以及菌落颜色等一系列特征。并将分离得到的乳酸菌进行革兰氏染色，放置在100倍油镜下进行菌体形态学观察[9]，拍照并记录乳酸菌菌落形态和大小等结果。

1.7 乳酸菌总DNA的提取以及纯度的检测

将筛选出的1～10周的乳酸菌单个菌落分别接种至含有50 mL MRS的液体培养基中，在37 ℃条件下，150 r/min摇床中培养过夜。按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取其中的乳酸菌总DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组OD260 nm/OD280 nm的比值以及DNA的浓度，然后再次通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.8 16S rDNA序列的PCR扩增

25 μL PCR反应体系：模板1 μL、上下游引物(细菌16S rDNA通用引物27f和1495r)各1 μL(10 pmol/μL)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，使用超纯水补齐到25 μL。其PCR的反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，设置30个循环，72 ℃延伸10 min[10-12]，最后4 ℃保温。PCR反应的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增结果，将胶板放置在凝胶成像系统中观察并拍照，同时检测是否含有约1500 bp的荧光条带。将最终的PCR结果呈现阳性的扩增产物寄送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行分析测序。

1.9 乳酸菌16S rDNA同源性分析及其种属的鉴定

登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网站，对PCR产物的测序结果进行同源性分析和比对，从数据库中获得相关种属的细菌16S rDNA序列信息[13,14]。以16S rDNA的序列同源性大于99%以上作为标准进行属种归类，然后对乳酸菌待测菌株以及相关的模式菌株进行16S rDNA序列分析，并应用软件Mega 7.0中的Neighbor-Joining法对系统发育树进行构建，进一步进行种属的鉴定[15]。

2 结果与分析

2.1 传统发酵豆酱样品中乳酸菌的分离结果

从不同发酵时期的豆酱样品中分离出革兰氏阳性疑似菌株共10株，经过氧化氢试验发现全部为阴性菌株，在含有2 g/dL CaCO3的MRS固体培养基上，菌株的菌落形态全部呈现为乳白色，观察其边缘比较规则，显示为圆形菌落，菌落直径大小在1.0～1.5 mm范围之内，通过观察菌落表面的情况，发现有的菌落相对光滑，而部分菌落表面呈现粗糙状态，并将其分别命名为SBP1-1、SBP1-2、SBP1-3、SBP1-4、SBP1-5、SBP1-6、SBP1-7、SBP1-8、SBP1-9、SBP1-10。同时对分离获得的10株疑似菌株进行革兰氏染色鉴定，并在100倍油镜下观察菌体的特征。镜检结果表明，所分析的菌株均表现为革兰氏阳性菌株，其菌体形态全部呈现为圆球状，排列方式多种多样，表现为单个、短链以及成对等多种方式。部分乳酸菌疑似菌株的革兰氏染色镜检结果见图1，其形态学特征见表1。

图1 部分乳酸菌疑似菌株的革兰氏染色结果图(×100)

表1 分离获得的各乳酸菌的形态学特征

2.2 乳酸菌总DNA的提取以及16S rDNA扩增结果检测

按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取分离纯化的乳酸菌总DNA，采用微量紫外-可见分光光度计检测分离得到的10株乳酸菌疑似菌株DNA的浓度和纯度，结果发现所检测菌株的DNA质量浓度全部在200 ng/μL左右，且OD260 nm/OD280 nm的比值基本处于1.6～1.8之间，基本符合PCR扩增体系的要求，可以继续进行下一步的PCR扩增实验。

将大酱中不同发酵时期分离出的乳酸菌16S rDNA扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图2，可以观察到在1～10周的大酱发酵过程中全部泳道在1500 bp左右的位置都出现了一条亮带，且在其他位置都没有出现明显的非特异性扩增条带，完全符合序列测定要求。将PCR扩增片段大小在1500 bp左右的阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定及分析。

图2 乳酸菌株16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 乳酸菌16S rDNA同源性的分析及其相关种属鉴定

登录NCBI(The National Center for Biotechnology Information)网站，将分离获得的乳酸菌16S rDNA/rRNA测序结果与该网站数据库中相关信息进行BLAST同源性分析和比对。发酵豆酱中分离纯化得到的10株乳酸菌16S rDNA序列同源性比对的相关结果见表2。

表2 吉林市农家传统发酵豆酱中分离的乳酸菌16S rDNA序列鉴定结果

由表2可知，分离得到的SBP1-1等6株菌与Pediococcuspentosaceus的相似性达到100%或99%，因此将其鉴定为戊糖片球菌(P.pentosaceus)；筛选出的SBP1-7等3株菌与Enterococcusfaecium的相似性达到99%，因此将其鉴定为屎肠球菌(E.faecium)；分离获得的SBP1-9菌株与Enterococcuslactobacillus的相似性达到100%，所以将其鉴定为乳酸肠球菌(E.lactobacillus)。

2.4 不同时期传统发酵豆酱样品中乳酸菌系统发育树的构建

登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网站，从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中获取信息进行同源性分析，从中提取相似度在99%以上的乳酸菌相关模式菌株的序列，在传统发酵豆酱中分离鉴定的3种乳酸菌中分别各选取1株作为代表菌株，通过Mega 7.0进化树软件并采用其中的Neighbor-Joining(NJ)法将测序获得的乳酸菌序列与GenBank数据库中模式菌株16S rDNA序列进行比对和分析，同时构建系统发育树，获得发酵豆酱中乳酸菌目的菌株的分类地位以及它的系统发育地位。通过软件获得系统发育树的结果见图3，由其结果可以看出，SBP1-1、SBP1-7、SBP1-9与相对应的参考菌株同源性较高，都达到99%以上，并与其聚在一起，从而有效地证明传统发酵豆酱中乳酸菌16S rDNA区域序列分析比对的结果有较好的准确性。

图3 吉林市传统发酵豆酱分离鉴定的乳酸菌16S rDNA序列分析系统发育树

3 结论

本研究从吉林市农家自制大酱的不同发酵阶段采集的10份样品中，共分离获得10株乳酸菌，通过16S rDNA序列分析法对分离得到的乳酸菌进行分析和鉴定，其鉴定结果分别为戊糖片球菌(P.pentosaceus)6株、屎肠球菌(E.lactobacillus)3株，乳酸肠球菌(E.lactis)1株。可以初步推断出戊糖片球菌是吉林市农家自制豆酱发酵过程中的优势乳酸菌群，对传统豆酱的风味起着至关重要的作用。