迷迭香提取液的抑菌作用及稳定性研究

孙长花，丁娟芳，王君，李晓凤

(1.扬州市职业大学 生物与化工工程学院，江苏 扬州 225009；2.扬州大学 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏 扬州 225009)

随着人们食品安全意识的提高和化学防腐剂残留问题的凸显，人们对天然防腐剂的需求不断增加，因此安全高效的天然植物源防腐剂受到广泛关注[1]，其中，天然食用香辛料具有抑菌、抗氧化作用[2,3]，其防腐保鲜研究已经成为热点。迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)，属唇形科迷迭香属植物，是一种具有悠久栽培历史和食用历史的天然香料植物[4]。迷迭香中有效成分为迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸等，具有抑菌、抗氧化、消炎等功效[5-8]。迷迭香提取物已被列入欧盟有机食品添加剂名单[9]。目前，关于迷迭香中抑菌成分的研究主要集中于提取方法 以及在食品防腐保鲜和抗氧化方面的应用[10-18]，而未见其抑菌稳定性的研究报道。本文旨在对迷迭香提取液的抑菌作用、最小抑菌浓度及影响抑菌稳定性的因素进行系统研究，以期为迷迭香开发成安全高效的天然食品防腐剂和抗氧化剂并运用于食品防腐保鲜提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

迷迭香：产地云南，购自扬州众成堂大药房；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌：均由扬州市职业大学微生物实验室提供；平板计数琼脂培养基、酵母粉、牛肉浸膏、琼脂；无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、丙酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铁、硫酸亚铁：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机 永康市铂欧五金制品有限公司；JA2003N电子天平 上海精密仪器有限公司；PHS-3G酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪 上海贤德实验仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHG-9003电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HPX-80生化培养箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 迷迭香提取液的制备

采用超声波辅助提取获得迷迭香提取液。迷迭香干燥后粉碎，过80目筛。准确称取一定量的粉末，按照料液比1∶10加入80%乙醇溶液，置于超声波细胞粉碎仪中，恒温50 ℃，浸提50 min。采用真空泵抽滤，收集滤液，真空低温旋转蒸发，制得迷迭香提取液。

1.3.2 菌悬液的制备

将实验室提供的菌种进行活化，用平板稀释法测定菌落总数。活化后的细菌用无菌生理盐水稀释为含菌数5×108CFU/mL的菌悬液。

1.3.3 抑菌圈的测定

通过琼脂打孔法测定提取液抑菌圈[19]。采用双层平板法，即先倒入10 mL左右培养基，冷却凝固后，滴加100 μL菌悬液于平板上，再倒入5 mL培养基充分混匀。用直径为6 mm的琼脂打孔器均匀打孔，各取50 μL提取液至孔中。将培养皿正置放于恒温培养箱中，37 ℃培养24 h，观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径。每组重复3次，取平均值。设置无菌水作阴性对照。

1.3.4 最低抑菌浓度

采用二倍稀释法[20]，将迷迭香提取液(500 mg/mL)用无菌水稀释为原液的100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125% 6个浓度(即提取液浓度分别为500.0，250.0，125.0，62.50，31.25，15.625 mg/mL)，分别吸取1 mL不同稀释度的提取液至无菌平皿中，再加15 mL培养基，充分混合均匀。待培养基冷却凝固后，取100 μL供试菌悬液于平板上，均匀涂布。将培养皿倒置放于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察供试菌生长状况，每组重复3次。

1.3.5 数据处理与分析

采用Graphpad Prism 7.0进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 迷迭香提取液的抑菌作用

迷迭香中含有迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等抑菌成分，对超声波提取的迷迭香提取液进行抑菌试验，迷迭香提取液对食品中常见的腐败菌和致病菌的抑菌效果见图1。

图1 迷迭香提取液对食品中常见细菌的抑菌效果

由图1可知，迷迭香提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较好的抑菌效果，形成明显的抑菌圈。迷迭香提取液对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.4 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为19.2 mm，对表皮葡萄球菌的抑菌圈直径为33.7 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为22.1 mm。

2.2 迷迭香提取液的最低抑菌浓度

采用二倍稀释法研究迷迭香提取液的最低抑菌浓度。不同浓度的迷迭香提取液对4种供试菌的抑菌效果见表1和图2。

表1 迷迭香提取液的最低抑菌浓度

图2 不同浓度的迷迭香提取液的抑菌效果

由表1和图2可知，通过比较不同平皿的受试菌生长情况，迷迭香提取液对不同菌种有不同的最低抑菌浓度。迷迭香提取液浓度不低于62.50 mg/mL时，均可以有效地抑制受试细菌的生长，当浓度稀释到31.25 mg/mL时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌出现菌落；当浓度稀释到15.625 mg/mL时，枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌出现少量的菌落。因此，迷迭香提取液对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌作用大于对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，并且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度为62.50 mg/mL，对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为31.25 mg/mL。

2.3 热处理对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

热处理是食品加工过程中的常用工序。将迷迭香提取液分别在65，80，100，121 ℃下处理 30 min，以未处理过的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌实验，以确定其抑菌作用的热稳定性，结果见图3。

图3 热处理对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

由图3可知，经过不同温度的热处理，迷迭香提取液的抑菌作用变化不明显。经过65，80，100 ℃的热处理，提取液对4种供试菌的抑菌圈直径变化趋势平缓，变化幅度不超过6.2%，抑菌作用稳定，抑菌效果较好。121 ℃处理后，提取液的抑菌圈直径略减小，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈减幅分别为8.5%、6.3%、9.5%、9.2%，抑菌效力略降低，但仍保持良好的抑菌效果，表明迷迭香提取液具有较强的热稳定性，能够适应食品加工过程中的多种热处理条件。

2.4 pH对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

不同的食品，pH也不同。用丙酸溶液和NaOH溶液将提取液的 pH 分别调为 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，以未处理的提取液(pH为6.4)作对照，分别对供试菌进行抑菌实验，以确定pH对提取液抑菌作用的影响，结果见图4。

由图4可知，迷迭香提取液的抑菌效果受pH的影响，且变化显著。与对照相比，当pH值为2.0时，提取液的抑菌圈直径明显减小，减幅分别为大肠杆菌 32.9%、金黄色葡萄球菌37.5%、枯草芽孢杆菌34.1%、表皮葡萄球菌29.1%，抑菌活力降低明显；当pH值为4.0～6.0时，提取液抑菌圈直径略有增加，抑菌活力强、效果好；当pH值为8.0时，抑菌圈直径减小，金黄色葡萄球菌减小最明显，降幅为19.6%，表皮葡萄球菌降幅最小(8.0%)，提取液抑菌活力下降；当pH值为10时，抑菌圈直径显著减小，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的减幅分别为39.5%、42.2%、21.7%、27.5%，抑菌活力显著降低，抑菌效果较差。表明迷迭香提取液在弱酸性及中性条件时抑菌作用强，但是在强酸性、碱性环境下抑菌效果较差。因此，将迷迭香提取液应用于食品保鲜时，应避免强酸或碱性条件。

图4 pH对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

2.5 紫外照射对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

将迷迭香提取液分别在紫外灯下照射10，20，30，40 min，以未处理的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌实验，以确定紫外照射对提取液抑菌稳定性的影响，结果见图5。

图5 紫外照射时间对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

由图5可知，经过不同时长的紫外照射处理，迷迭香提取液的抑菌圈直径变化趋势平缓，提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径变化幅度分别小于6.3%、9.4%、8.0%、7.4%，抑菌效果基本无变化，抑菌作用稳定。表明迷迭香提取液抑菌性对紫外照射的稳定性较好。

2.6 金属离子对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

将迷迭香提取液分别加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等，以未处理的提取液作对照，分别对供试菌进行抑菌实验，以确定金属离子对提取液抑菌稳定性的影响，结果见图6。

图6 金属离子对迷迭香提取液抑菌稳定性的影响

由图6可知，迷迭香提取液加入K+、Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+等金属离子后，提取液的抑菌圈直径变化趋势平缓，变化幅度分别为大肠杆菌 6.8%、金黄色葡萄球菌8.3%、枯草芽孢杆菌5.7%、表皮葡萄球菌7.4%，抑菌活性较稳定。表明迷迭香提取液的抑菌作用对金属离子的稳定性较好，在加工中几乎不受金属离子的影响。

3 结论

迷迭香中有效抑菌成分主要是迷迭香酸、迷迭香酚、鼠尾草酸、鼠尾草酚等物质。迷迭香提取液对食品中常见的致病菌抑制作用明显，对大肠杆菌的抑菌圈直径为16.4 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为19.2 mm，对表皮葡萄球菌的抑菌圈直径为33.7 mm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为22.1 mm，并且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度为62.50 mg/mL，对枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度为31.25 mg/mL。

通过抑菌稳定性研究发现，迷迭香提取液具有较强的热稳定性，在酸性和中性条件下稳定性好，但在强酸和碱性条件下较不稳定，紫外和大多数金属离子均不影响其抑菌效果，因此，迷迭香可以适应多种加工条件，可广泛用于食品的防腐保鲜。

迷迭香来源广、易获取，将迷迭香提取后经过工艺调整运用到食品防腐保鲜中既可改善食品感官品质，也利于消费者身体健康，因此开发迷迭香防腐剂具有较好的应用前景。