猪冷冻精液生产操作规程

2020-12-01倪和民王相国北京农学院

中国畜牧业 2020年17期

关键词：细管冻精灌装

文│倪和民王相国（北京农学院）

邓晓彬朱宽峰蒋凡（北京田园奥瑞生物科技有限公司）

赵俊金（全国畜牧总站）

金通吴承武王文强（南京农业大学淮安研究院）

刘燊刘建（江西正邦养殖有限公司）

一、范围

本作业指导书确立了猪冷冻精液生产程序，规定了生产实验室选择、使用器械卫生要求、稀释液配制、采精、精液处理、精液冷冻、冻精解冻、质量检测、冻精包装和冻精贮存等阶段的操作指示，描述了过程记录、标记、试验方法等追溯方法。

本作业指导书适用于猪冷冻精液生产及贮存。

二、规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4143牛冷冻精液；GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范；GB/T 30396牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输；GB/T 5458液氮生物容器；NY/T 2077种公猪站建设技术规范；NY/T 1167畜禽场环境质量及卫生控制质量。

三、术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

1.冷冻精液（f r o z e n semen）。经特殊方法处理精液超低温冷冻后在液氮中（-196℃）长期保存。[GB 4143-2008，定义3.5]。

2.采精（semen collection）。采用人工手握公猪阴茎龟头模拟似有自然交配感的操作，以获得公猪精液。

3.原精液（e j a c u l a t e d semen）。采集后未经稀释的精液。[GB/T 23238-2009，定义3.1]。

4.精子活力（s p e r m motility）。在37℃环境下前进运动精子占总精子数的百分率。[GB/T 25172-2010，定义3.3]。

5.精子密度（s p e r m concentration）。单位体积精液中的精子数，单位为108个每毫升。［GB/T 25172-2010，定义3.4］。

四、猪冷冻精液生产程序的构成

猪冷冻精液生产程序包括9个阶段，其中精液处理阶段分为5个步骤。

五、猪冷冻精液生产

1.生产实验室。

（1）生产实验室主要包括采精室、精液生产室和精液质量检测室。

（2）基础设施能够保证生产经营的需要，其中采精室、精液生产室使用面积及条件应分别符合NY/T 2077中7.3和7.4的规定，精液质量检测室可参照NY/T 2077中7.5的要求。周围环境不准许有影响种猪健康和冻精质量的不良因素。

表1 冻精试剂成分组合

（3）环境条件应符合NY/T 1167中的规定。

（4）配备的仪器设备，其性能、精度、量程应能够满足冷冻精液生产与检验测试的需要，具体配置清单见附录A。为了保证设备能够正常的运转和测试结果的准确性，严格按照使用说明要求规范操作。对在用仪器设备应给予正常的维护，完好率100%。涉及量值器具与设备（天平、温度计、恒温箱等）应定期进行检定和校准。

（5）实验室内布局合理，在用仪器设备应按使用的先后，顺时针方向摆放。

2.器械卫生要求。器械及器皿清洗方式方法，通常为手工清洗或使用超声波清洗机。器具的消毒灭菌，应按照不同材质分别采用对应的方式方法，玻璃器皿类清洗洁净后，采用电热恒温干燥箱高温灭菌消毒；对于一些不耐高温材质的，如橡胶、塑料制品，采用75%酒精擦拭消毒或紫外线灯照射、臭氧消毒。

3.冻精试剂。

（1）所用的冻精试剂应选择分析纯；稀释用水为双重蒸馏水；提供新鲜卵黄的鸡蛋应是来源于无疫病鸡场；添加使用的抗生素应在有效期内。

（2）试剂配制过程中应严格按照配方要求、准确称量、先后顺序、规范操作。配制完成后应及时在试剂容器上明确标记试剂的名称、配制日期、保质时间等。

（3）冻精试剂拆封后，应先检查试剂包装标识，所用试剂符合表1中各项试剂成分组合，并严格按照TYP-5猪冻精试剂使用方法说明书的要求操作。

表2 原精液质量要求

（4）通常冻精生产前准备好各种冻精试剂。预稀释剂试剂A配制好，使用前水浴至37℃待用。基础营养液（Ⅰ液）试剂B加卵黄，使用前置于恒温箱内17℃保存、待用。冷冻保护剂（Ⅱ液）基础营养液（Ⅰ液）加试剂C和试剂D，使用前置于平衡柜中4℃冷藏、待用。解冻剂试剂E配制好，使用前水浴至30℃（26～32℃）待用。

（5）不准许使用过期或已变质的稀释液。

4.采精。

（1）采精公猪体质健康，具有种用价值。

（2）采精操作，按照GB/T25172中4.1～4.3方法。根据公猪射精特点，应舍去最初和最后部分精液，采集完成后立即送入精液处理室。

5.精液处理。

（1）工作准备。精液处理室室内控温设备、恒温水浴箱、显微镜恒温载物台、精子密度测定仪、电子天平、恒温箱、低温操作柜和恒温操作间等均应提前开机预冷（热）待用。凡是接触精液的器皿应按使用要求分别放置于不同环境温度中预冷（热）待用。

（2）原精液质量检测。精液处理室及时记录采精日期、品种、公猪号等有关信息。观察精液的色泽，准确进行采精量、精子活力、密度、畸形率的检测，检测方法见GB/T 25172中5.3.1～5.3.6。及时记录检测的时间、地点、检测项目、结果及检测人。只准许检测结果符合表2中质量要求的精液方可进入精液处理阶段。

（3）添加保护液。符合质量要求的原精液，缓缓加入等量的预稀释剂（1∶1），摇匀、标记后，置于精液程控平衡仪，平衡仪初始温度设置与预稀释精液温度一致，结束温度为17℃，平衡时间设置为90～120分钟。

（4）精液离心。离心前应准确称量离心管净重（克），做好标记。降、恒温后精液在17℃环境条件下800～900克离心10分钟，舍去上清液。离心后及时称量离心管加精子重（克）。精子体积按式（1）计算：v＝w1－w0

式中：v——精子体积，单位为毫升；w1——离心瓶加精子重，单位为克；w0——离心瓶重，单位为克。

（5）稀释、平衡。计算总精子数（个）＝精液量（毫升）×精子密度（亿/毫升）。可生产数（支）＝总精子数（亿）÷每支细管中精子数（亿）。稀释总量（毫升）＝可生产数（支）×每支细管灌装量（毫升）。稀释液添加量（毫升）＝稀释总量（毫升）－精子体积（毫升）。注：每支细管实际灌装量：微型≈0.20（毫升），中型≈0.45（毫升）。稀释液添加量计算公式按式（2）计算：

式中：v——稀释液添加量，单位为毫升；v1——采精量，单位为毫升；c——精子密度，单位为个（108/毫升）；s——每支份含总精子数，单位为个（108/支份）；v2——每支份剂量值，单位为毫升；v3——精子体积，单位为毫升。

稀释。一次稀释。在精子体积中缓缓加入基础营养液（Ⅰ液），至稀释总量的一半，轻轻摇匀后将稀释精液置于精液程控平衡仪，平衡仪初始温度设置为17℃，结束温度为4℃，平衡时间设置为60～90分钟。

二次稀释。平衡结束后，将冷冻保护剂（Ⅱ液）加入至稀释总量，缓缓加液并轻轻摇动。

（6）灌装。全自动冻精细管灌装封口一体机开机测试，置于恒温操作间或在低温平衡柜中进行灌装、封口，细管喷码机进行细管标记。不准许精液封装过程中发生温度回升，精液灌装环境温度应始终控制在3～5℃范围内。灌装封口完成后及时将细管精液在冷冻架上码放，操作时细管棉塞封口端靠近操作者，超声波封口端远离操作者。每架上放有标记物，便于识别。如同一架上有不同公猪的细管精液，也要做好标记，便于识别，以免混淆。

6.精液冷冻。

（1）选择使用程控冷冻仪完成对细管精液的冷冻，调用猪冻精专用降温曲线程序。

（2）精液冷冻前应提前开机，对冷冻仪腔室实施降温、预冷至4℃稳定、待用。

（3）将已上架码放好的细管精液迅速转移至冷冻腔室内。

（4）选择猪精液冷冻程序，通过计算机软件系统控制冷冻腔室内降温速度（曲线）。

（5）冷冻完成打开冷冻仪盖板，迅速将细管精液取出，按照采精公猪号分别投入盛满液氮的不同容器中。

（6）取放时，细管的封口端在上，棉塞端向下，不可倒置。不准许精液脱氮。

7.精液解冻。将细管精液迅速放入在50℃温水中轻轻摆动，解冻时间为15～16秒。取出，擦干水迹，剪去细管两端，将精液移入指形管中，用26～35℃预热后的解冻剂10倍稀释，保存10分钟后待检。

8.冻精检测。

（1）对解冻后精子活力、畸形率的检测，方法见GB/T 25172中5.3.3、5.3.5。

（2）每批/头细管的检测，不少于3支。

9.冻精包装、贮存。检测合格定留存的精液装入拇指管和纱布袋中做好生产日期和猪号标记，转入低温容器液氮中贮存，贮存要求见GB/T 30396中7.1～7.4。