金银花的HPLC指纹图谱建立及其抗炎作用谱-效关系研究

2020-11-30缪艳燕徐帮会徐剑张永萍刘杰刘耀

中国药房 2020年20期

缪艳燕徐帮会徐剑张永萍刘杰刘耀

摘要目的：建立金银花指纹图谱，并研究其抗炎作用的谱-效关系。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）。色谱柱为Diamonsil C18，流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为238 nm，进样量为10 μL。以绿原酸为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》建立10批不同产地金银花药材样品的HPLC指纹图谱;通过对照品比对，指认共有峰对应的化学成分，并进行相似度分析。采用二甲苯、角叉菜胶及棉球诱导的急、慢性炎症小鼠模型评价10批金银花药材水提物对耳、足、肉芽肿的肿胀抑制率，并计算平均值，作为综合药效指标;基于共有峰峰面积和综合药效指标，采用灰色关联度分析法（GRA）和偏最小二乘回归分析法（PLSR）联合分析金银花指纹图谱与抗炎作用的谱-效关系，选择GRA关联度大于0.7且PLSR模型回歸系数大于0的色谱峰为特征峰，计算10批金银花药材中特征峰峰面积占共有峰峰面积总和的百分比（即“峰占比”）。结果：10批金银花药材样品的HPLC指纹图谱中有共有峰25个，相似度为0.775～0.994;指认出其中9个成分，分别为芦丁（峰18）、金丝桃苷（峰20）、异绿原酸B（峰22）、木犀草素（峰21）、绿原酸（峰9）、马钱苷（峰10）、新绿原酸（峰2）、异绿原酸C（峰25）、异绿原酸A（峰23）。10批金银花对小鼠耳肿胀、足肿胀、肉芽肿均具有抑制作用，抑制率平均值为47.95%～56.52%;GRA分析显示，关联度由大到小依次为峰8>12>18>16>3>11>20>22>19>21>1>9>10>13>24>14>2>17>25>23>5>4>15，且其关联度均大于0.7;峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24的PLSR模型回归系数均大于0，与抗炎作用成正相关;除峰7外，其余均为特征峰，且峰5、8、10、16、18、20、24的变量重要性投影值均大于1。10批金银花药材特征峰的峰占比为58.61%～71.19%。结论：成功建立金银花的HPLC指纹图谱，10批样品组分相似，抗炎成分含量相对较高;暂定金银花特征峰峰占比不得低于51.8%。

关键词金银花;高效液相色谱法;指纹图谱;抗炎作用;谱-效关系;灰色关联度;偏最小二乘法

中图分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）20-2497-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.12

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish fingerprint of Lonicera japonica， and to study its anti-inflammatory spectrum-effect relationship. METHODS： HPLC was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was 238 nm. The sample size was 10 μL. Using chlorogenic acid as reference， HPLC fingerprint of 10 batches of L. japonica from different production areas was established according to TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）. By comparing with reference substance， chemical constituents corresponding to common peaks were identified， and the similarity analysis was conducted. Acute and chronic inflammatory models of mice induced by xylene，carrageenan and cotton ball were used to evaluate inhibition rate of 10 batches of L. japonica to ear， foot and granuloma swelling; the average value was calculated as the comprehensive pharmacodynamic index. The spectrum-effect relationship with HPLC fingerprint of L. japonica and anti-inflammatory effect was analyzed by grey relational analysis （GRA） and partial least squares regressiosn （PLSR） based on common peak area and comprehensive pharmacodynamic index. Chromatographic peaks with correlation>0.7 and regression coefficient of PLSR model>0 were characteristic peaks. The percentage of peak areas of characteristic peaks to peak areas of common peak was calculated in 10 batches of L. japonica （e.g. “peak ratio”）. RESULTS： There were 25 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of L. japonica， with similarity of 0.775-0.994. Totally 9 peaks were confirmed， i.e. rutin （peak 18）， hyperoside （peak 20）， isochlorogenc acid B （peak 22）， galuteolin （peak 21）， chlorogenc acid （peak 9）， loganin （peak 10）， neochlorogenic acid （peak 2）， isochlorogenic acid C （peak 25）， isochlorogenic acid A （peak 23）. All 10 batches of L. japonica had inhibitory effects on ear swelling， foot swelling and granuloma， with average inhibitory rate of 47.95%-56.52%. The correlation by GRA was peak 8>12>18>16>3>11>20>22>19>21>1>9>10>13>24>14>2>17>25>23>5>4>15， and all of correlations were greater than 0.7. The regression coefficient of PLSR for peaks 2， 4， 5， 7， 8， 10， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 20， 21， 22， 24 were all greater than 0; those peaks were positively correlated with anti-inflammatory effect and were characteristic peaks except for peak 7; among them， VIP values of peaks 5， 8， 10， 16， 18， 20， 24 were greater than 1. The peak ratio of 10 batches of L. japonica was 58.61%-71.19%. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint of 10 batches of L. Japonica is successfully established. 10 batches of samples have similar components， and the content of anti-inflammatory components is relatively high. The proportion of characteristic peaks to common peaks should not be less than 51.8%.

KEYWORDS Lonicera japonica; HPLC; Fingerprint; Anti-inflammatory effect; Spectrum-effect relationship; Grey relational analysis; Partial least squares

金银花Lonicerae Japonicae Flos为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或待初开的花，主要分布于我国贵州、河南、山东和湖北等地，其经济、食用及药用价值较高，属药食同源植物[1]。金银花作为药用历史悠久的中草药，具有抗病毒、抗肿瘤、提高免疫和抗氧化等诸多功效[1-2]。目前，已有关于金银花指纹图谱及其抗炎药效的研究，如刘惠等[3]建立了不同批次金银花的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，结果表明，10批金银花指纹图谱的相似度均在0.92以上;胡璇等[4]对四倍体金银花水提物的抗炎作用进行了研究，结果表明，该水提物具有明显的抗炎作用。但是，目前尚无研究探讨指纹图谱与抗炎药效的直接内在联系[5]。基于此，本研究采用灰色关联度分析法（GRA）与偏最小二乘回归分析法（PLSR）联合建立金银花指纹图谱与抗炎药效的谱-效关系，以期从该药中筛选出与抗炎药效密切相关的化学成分，旨在为金银花的抗炎物质基础研究和临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪（美国Agilent公司）;AE240型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];SK8210LHC型超声波清洗仪（上海商信化玻仪器有限公司）;HHW21.600AⅡ型恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

10批金银花药材（编号：S1～S10）经贵州中医药大学生药学教研室孙庆文教授鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica Thunb.的干燥花蕾或待初开的花，其来源信息详见表1。

1.3 动物

昆明种小鼠，清洁级，雌性，2月龄，体质量（20±2）g，购自长沙市天勤生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液取金银花药材适量，粉碎，过40目筛，精密称取粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加水25 mL，称定质量，加热回流提取2 h，放冷至室温，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液，备用。

2.1.2 对照品溶液分別精密称取马钱苷、木犀草苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、新绿原酸、金丝桃苷、芦丁对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成上述成分质量浓度分别为13.2、10.8、7.3、7.1、7.5、7.6、12.8、18、15 μg/mL的单一对照品溶液，备用。

2.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～18 min，7%A→8%A;18～30 min，8%A→12%A;30～50 min，12%A→20%A;50～60 min，20%A;60～65 min，20%A→25%A;65～70 min，25%A→30%A;70～80 min，30%A→7%A）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：238 nm;进样量10 μL。

2.3 指纹图谱的建立与分析

2.3.1 精密度试验取同一批金银花药材（编号：S2）适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积。以绿原酸（即峰9，分离度好且峰形对称）为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，相对保留时间的RSD均小于1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验取同一批金银花药材（编号：S2）适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，相对保留时间的RSD均小于2.5%（n=7），相对峰面积的RSD均小于3%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验取同一批金银花药材（编号：S2）适量，共6份，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸峰（峰9）为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，相对保留时间的RSD均小于1%（n=6），相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.3.4 HPLC指纹图谱的生成分别取10批金银花药材样品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以S2为参照图谱（因S2图谱的色谱峰信号相对较强且峰形明显），设置时间窗宽度为0.1 s，采用多点校正法进行色谱峰匹配，生成10批金银花药材样品的HPLC叠加指纹图谱，详见图1;采用中位数法生成对照指纹图谱（R），详见图2。

2.3.5 共有峰指认由图1和图2可见，10批金银花药材样品含共有峰25个，通过与对照品（取“2.1.2”项下9种单一对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，其叠加色谱图见图3）比对，指认出其中9个成分，分别为新绿原酸（峰2）、绿原酸（峰9）、马钱苷（峰10）、芦丁（峰18）、金丝桃苷（峰20）、木犀草苷（峰21）、异绿原酸（峰22）、异绿原酸A（峰23）、异绿原酸C（峰25）。

2.3.6 相似度评价将10批金银花药材样品的HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价。结果，10批样品的相似度在0.775～0.994范围内，详见表2。

2.4 抗炎作用研究

2.4.1 金银花水提取液的制备分别称取金银花药材适量，分别用12、10、10倍量水（mL/g）加热回流提取3次，每次2 h，合并滤液，浓缩，制成质量浓度为0.6 g/mL（以生药量计）的药液。

2.4.2 小鼠耳肿胀实验参照文献方法[6]进行小鼠耳肿胀实验。将156只小鼠随机分成13组，分别为空白对照组、化学药阳性对照组（阿司匹林肠溶片，20 mg/kg）、中药阳性对照组（蒲地蓝消炎片，7.68 mg/g）和10批金银花组[记为S1～S10组，金银花水提取液，12 mg/g（以生药量计）]，每组12只。化学药阳性对照组和中药阳性对照组给药剂量按相应品种的临床成人1日剂量计，S1～S10组给药剂量按《中国药典》中金银花药材的1日剂量计。除空白对照组小鼠灌胃等体积生理盐水外，其余各组小鼠均灌胃相应药物，每日1次，连续15 d。末次给药30 min后，于各组小鼠右耳正反两面均匀涂抹二甲苯50 μL致炎，并以左耳作为对照。30 min后，将各组小鼠颈椎脱臼处死，用直径8 mm打孔器在左右耳相对称部位取耳片，分别称定质量，并按以下公式计算耳肿胀度和肿胀抑制率：耳肿胀度=右耳质量-左耳质量，肿胀抑制率=（右耳质量-左耳质量）/左耳质量×100%[7]。采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析;计量资料均以x±s表示，组间比较采用t检验;P<0.05为差异有统计学意义。结果，与空白对照组比较，化学药阳性对照组、中药阳性对照组和S1～S10组小鼠耳肿胀度均显著降低（P<0.01），说明10批金银花均能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎症肿胀，其中河北获鹿产金银花的抗炎作用相对较强（耳肿胀抑制率为49.13%），详见表3。

2.4.3 小鼠足肿胀实验参照文献方法[6]进行小鼠足肿胀实验。取小鼠156只，按“2.4.2”项下方法分组、给药。于末次给药1 h后，在每只小鼠右后足跖部皮内注射1%角叉菜胶0.1 mL，分别于注入前及注入后1、2、3、4、6 h测定右后足容积，并按以下公式计算足肿胀抑制率：足肿胀抑制率（%）=[（空白对照组平均足肿胀度-给药组平均足肿胀度）/空白对照组平均足肿胀度]×100%[8]。按“2.4.2”项下方法对数据进行统计分析。结果，10批金银花对角叉菜胶所致的小鼠足炎症肿胀均有抑制作用，其中河南新乡产金银花的抗炎作用相对较强（足肿胀抑制率为59.86%～79.51%），详见表4。

2.4.5 抗炎综合药效值的确定由于耳肿胀实验和足肿胀实验模拟的是急性炎症，肉芽肿实验模拟的是慢性炎症[10]，因此耳肿胀抑制率、足肿胀抑制率（6 h）和肉芽肿抑制率对评价抗炎效果具有相同的重要性。因此，基于层次分析法[11-12]赋予上述3个指标相同的权重系数，以其平均值作为抗炎综合药效指标，结果见表6。

2.5 谱-效关系分析

2.5.1 GRA 以金银花抗炎综合药效作为参考数列，指纹图谱中色谱峰的峰面积作为比较数列，以初值化变换法对原始数据进行无量纲化处理，并计算GRA的关联度[13]，结果见表7。由表7可见，金银花各成分对抗炎效果的贡献大小依次为：峰8>12>18（芦丁）>16>3>11>20（金丝桃苷）>22（异绿原酸B）>19>21（木犀草素）>1>9（绿原酸）>10（马钱苷）>13>24>14>2（新绿原酸）>17>25（异绿原酸C）>23（异绿原酸A）>5>4>15，且其关联度均大于0.7，表明金银花中抗炎成分相对较多，其抗炎作用可能是多组分共同作用的结果。

2.5.2 PLSR分析以金银花指纹图谱中各共有峰的峰面积为自变量（X），以金银花抗炎综合药效为因变量（Y），采用SIMCA 14.1软件进行PLSR分析，计算X对应Y的回归系数和变量重要性投影（VIP）值，结果见图4。由图4可见，10批金银花样品的25个共有峰中，峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24的PLSR模型回归系数均大于0，与抗炎效果成正相关，其中峰5、8、10、16、18、20、24的VIP值>1，表明上述成分对抗炎效果具有显著影响。

2.6 金银花药材质量评价指标的建立

结合“2.5”项下结果，选择同时满足GRA中关联度大于0.7和PLSR中与抗炎药效成正相关的色谱峰为特征峰（色谱峰2、4、5、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24），其峰面积之和记为Q。结合药效数据，金银花Q值越大表明其抗炎作用越強[14]。为避免因仪器、检测时间等条件的改变引起色谱峰峰面积的重现性问题所造成的系统误差，本研究采用“峰占比”（特征峰峰面积占共有峰峰面积总和的百分比来评价金银花药材中具有抗炎作用成分的相对比例，结果见表8。由表8可见，10批金银花药材峰占比的平均值为64.73%，按照质量标准研究方法，暂定以峰占比平均值的80%计为金银花质量评价的下限，即特征峰峰占比不得低于51.8%[14]。

3 讨论

本研究前期分别考察了不同提取方法（超声、回流）、不同提取溶剂（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇和水）对金银花提取率的影响，结果发现以水回流提取2 h的提取率最高。前期还分别考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同流动相（甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液）对色谱峰分离效果的影响，结果显示，当流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液、流速为1.0 mL/min时，相邻色谱峰的分离效果最好且峰形对称、无拖尾。

中药谱效关系研究是将中药指纹图谱（活性物质）与药效学研究结合起来，通过合理的谱-效模型和分析方法，系统揭示中药活性成分与药理作用之间的关系[15-16]。GRA是通过灰色关联度来分析和确定系统因素间的影响程度或因素对系统主行为贡献的一种测试方法，当关联度大于0.7时，各共有峰对药效有一定影响;且关联度越大则影响越强[17]。但GRA结果只能表达共有峰对药效的影响程度，具体是促进还是抑制则无法判断。PLSR在建模过程中集中了主成分分析、典型相关分析和线性回归分析方法的特点，通过PLSR模型回归系数的正负来判断各共有峰对药效影响的趋势，即正值为促进作用、负值为抑制作用[18]。因此，将两种分析方法联用，所得同时满足关联度大于0.7且PLSR模型回归系数为正值的共有峰为特征峰，其对应化合物即为对药效有较强促进作用的特征成分。

本研究成功建立了10批金银花药材样品的指纹图谱，确认了25个共有峰，相似度为0.775～0.994，表明此10批金银花药材样品质量基本稳定，其中个别相似度较低的原因可能与栽培方式、采收加工方法等不同有关。通过GRA和PLSR分析进一步明确了25个共有峰中的17个与抗炎药效有密切的正相关性，除峰7外，其余均为特征峰，10批金银花药材的峰占比为58.61%～71.19%，暂定特征峰峰占比不得低于51.8%，作为评价金银花药材是否合格的最低限。

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