石菖蒲及α-细辛醚对疲劳运动大鼠学习记忆的影响及其机制*

朱梅菊，毛泽华，郭红英, 朱洪竹, 丁孝民

(1.井冈山大学体育学院, 江西 吉安 343009; 2.井冈山大学后勤保障处, 江西 吉安 343009；3.井冈山大学继续教育与培训学院, 江西 吉安 343009)

石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)为天南星科菖蒲属植物石菖蒲的干燥根茎, 为历代延年、益智的要药，《神农本草经》将其列为上品，属于增力类中药之一。研究表明：石菖蒲具有较明显的抗运动性疲劳作用[1]。又目前大量研究证实，当机体处于疲劳状态时，学习记忆功能受到明显抑制。而现在能有效改善疲劳机体学习记忆的药物较少。石菖蒲及其活性成分-β-细辛醚对学习记忆影响的报道较多[2]。但石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚对疲劳机体学习记忆影响的报道较甚少。海马自由基代谢失衡和nNOS/NO信号失调均与学习记忆下降密切相关[3-4]。为此，本研究拟运用疲劳运动方案，研究石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚对疲劳运动大鼠学习记忆、海马自由基代谢和nNOS/NO信号的影响，为石菖蒲在运动医学领域的应用和新的益智类药物的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理方法

80 只、6 周龄、清洁级的雄性SD大鼠，体重(205±19)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(动物生产许可证: SCXK(湘)2011-0003, 动物使用许可证: SYXK(赣)2017-0003)。实验地点：井冈山大学医学部重点实验室。分笼饲养，自然光照，动物房内温度(20±3)℃，相对湿度为(40～60)%。适应性饲养2 d后, 按完全随机法分为正常对照组(A)、单纯运动组(B)、运动+α-细辛醚低、中、高剂量组(C、D、E)、运动+石菖蒲低、中、高剂量治疗组(F、G、H)，共8 组，每组10 只。石菖蒲低、中、高剂量分别按石菖蒲提取物 每公斤体重 0.12、1.20 和 4.80 g，α-细辛醚低、中、高剂量分别按α-细辛醚 每公斤体重 0.10、0.50 和 1.00 mg，ig。每只大鼠每次灌胃的体积均为2 ml，每天 ig 1 次；正常组、单纯运动组以等体积生理盐水 ig。药物剂量换算参照文献[5]和预实验结果。每次灌胃时间在运动前 2 h。实验时间10 d。

1.2 石菖蒲提取物的制备

石菖蒲1 kg，购自昆明市药材局，由中国科学院昆明植物研究所谭宁华研究员鉴定为天南星科菖蒲属禾草状多年生草本植物石菖蒲(acorustatarinowiiSchott)的根茎。首先用二氧化碳超临界萃取法提取石菖蒲挥发油。然后将药物残渣用95%乙醇分别热提3次，3次提取液混合，减压浓缩成浸膏。再将乙醇提取后的中药残渣用水煎煮3次，在60℃水浴中浓缩成浸膏。最后将此三者合并为石菖蒲混合提取物，放4℃冰箱保存备用。石菖蒲提取物中含有α-细辛醚0.357% 和5-羟甲基糠醛0.015%。

1.3 石菖蒲中α-细辛醚的分离提取

干燥的石菖蒲 15 kg，粉碎后先用超临界CO2萃取仪提取挥发油。其残渣用95%乙醇热提3次，减压蒸馏得浸膏1 kg。将浸膏溶于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。回收溶剂得石油醚部分200 g。用氯仿-甲醇(9∶1～1∶1)对石油醚部分进行硅胶柱色谱分离，梯度洗脱，分得4个部分(F1～F4)。F1(10 g)经Sephadex LH-20色谱柱分离，石油醚-丙酮(10∶1)洗脱，HPLC制备，得到α-细辛醚(200 mg)。α-细辛醚的纯度为95%。

1.4 疲劳运动方案

疲劳运动方案按文献进行[6]。B-H组动物进行3 d 适应性跑台训练后开始10 d 的正式跑台运动, 负荷分3级，每级跑速分别为8、15、20 m/min，第1、2级分别运动15 min，第3级运动直至大鼠无法维持跑台预定跑速，滞留于跑道后端3次以上，使用声波和光、电刺激驱赶仍无效，并伴有呼吸急促，腹卧跑台等行为表现。正常对照组动物相同条件常规饲养, 不参加跑台运动。

1.5 水迷宫实验程序

采用Morris水迷宫(淮北正华)实验测试大鼠空间学习记忆能力。水迷宫测试采用圆形水池(直径120 cm，高60 cm)，水温(22±1)℃，低于水面1 cm 处放置一个全透明的塑料圆形平台(直径10 cm，高50 cm)，迷宫上方安置带有显示系统的摄像机，计算机自动跟踪计时并记录大鼠游泳轨迹。水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验。

1.5.1 定位航行实验(place navigation test, PNT) 动物购入后，进行PNT训练3 d。PNT训练即: 大鼠自由游泳15 min，使大鼠熟悉水池。然后将大鼠随机从东、西、南、北4个入水点面向池壁放入水中，记录大鼠在2 min 内寻找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)。如果大鼠在2 min 内未找到平台，采集系统将自动关闭，潜伏期按2 min计算。然后将大鼠引到平台上停留 15 s，2次训练间隔3～5 min。每只大鼠每天接受3次PNT训练，连续3 d。第4日进行PNT测验，取3次潜伏期平均值作为逃避潜伏期。水迷宫测验结束后B-H 组大鼠进行10 d跑台运动。跑台运动第7、8、9日，所有大鼠均需进行PNT训练。第10日跑台运动结束后，所有大鼠随后进行PNT测验，重复3次。

1.5.2 空间位置探索实验(spatial probe test, SPT) 用于测量大鼠对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。每次PNT测验结束后，撤去平台，从同一入水点面向池壁放入水中，记录大鼠2 min内，穿越原平台位置的次数。

1.6 脑组织的取材

最后一次SPT测试结束后即刻，用25%乌拉坦和0.9%戊巴比妥钠混合液按0.4 ml/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血后，冰浴中快速剥离双侧海马(称量), 置液氮中速冻，随后转移至-70℃冰箱保存待测。

1.7 海马脑组织SOD、NOS活性、MDA含量测定

脑组织匀浆液的上清液制备同免疫印迹法。SOD活性，采用黄嘌呤氧化酶法；NOS活性，采用比色法；MDA含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。实验操作流程严格按照试剂盒说明书中操作规程进行。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.8 免疫印迹法(Western blot)

在冰浴上用组织匀浆器制备海马脑组织匀浆液，用15 000 r/min、4℃低温离心15 min，吸取其上清。再重复离心一次。用BCA法进行蛋白浓度测量。样品蛋白用10.0% SDS-PAGE 分离，然后将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液(含5.0 % 脱脂奶粉，3.0% BSA，0.1%Tween-TBS)进行非特异性封闭常温2 h，洗涤4次，加入抗nNOS(按滴度1∶ 2 000稀释，美国Sigma公司)，4℃过夜。0.1% Tween-TBS 冲冼5 次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗HRP-IgG(按滴度1∶1 000 稀释,北京中山生物技术有限公司)37℃孵育2 h。0.1% Tween-TBS 冲冼6 次，加入ECL试剂(化学发光剂，美国Primer公司)进行曝光，X 线片记录影像。应用Fluorchem V 2.0 系统进行吸光度测定,以目的条带与内参照GAPDH平均吸光度的比值表示蛋白水平,进行半定量分析。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠学习记忆功能比较

实验前各组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数,差异无显著性,P均>0.05。实验后单纯运动组(B)大鼠逃避潜伏期显著长于正常组(A)，穿越平台次数明显少于A组，差异具有显著性，P均<0.01。石菖蒲及α-细辛醚中、高剂量组(D、E、G、H)大鼠逃避潜伏期分别短于B组；而穿越平台次数分别多于B组，P均<0.01。石菖蒲低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期依次为：ED>C，P均<0.01。α-细辛醚低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期依次为：HG>F，P均<0.01。α-细辛醚低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数分别与石菖蒲低、中、高剂量组比较，差异均无显著性，P均>0.05。E、H、A组大鼠逃避潜伏期和穿越平台次数，差异均无显著性(P均>0.05，表1)。提示石菖蒲和α-细辛醚均有一定的改善疲劳运动大鼠学习记忆作用，并呈一定的剂量依赖性。

Tab. 1 Comparison of learning and memory function among groups before and after n=10)

2.2 各组大鼠海马脑组织自由基代谢比较

各组大鼠海马脑组织自由基代谢比较见表2。可知：单纯运动组(B)海马脑组织SOD活性明显低于正常对照组(A), 而MDA含量明显高于A组，均P<0.01。石菖蒲中，高剂量组(D、E)和α-细辛醚中，高剂量组(G、H)海马脑组织SOD活性高于B组；而MDA含量显著低于B组，P<0.01或P< 0.05。石菖蒲低、中、高剂量组海马脑组织SOD活性依次为：H>G>F，MDA含量则相反，P均<0.01。α-细辛醚低、中、高剂量组海马脑组织SOD活性依次为：E>D>C,，而MDA含量则相反，P<0.05或P< 0.01。α-细辛醚高剂量组大鼠海马脑组织SOD活性低于石菖蒲高剂量组，而MDA含量则相反，P均<0.01。α-细辛醚低、中剂量组大鼠海马脑组织SOD活性分别有低于石菖蒲低、中剂量的趋势，而MDA含量趋势则相反，但差异均无显著性，P均>0.05。提示石菖蒲和α-细辛醚均具有较明显的纠正疲劳运动大鼠海马自由基代谢失调作用，并呈一定的剂量依赖性，且石菖蒲的效果强于α-细辛醚。

Tab. 2 Comparison of SOD activities and MDA contents in hippocampus of rats among eight groups n=10)

2.3 各组大鼠海马脑组织NOS活性和nNOS蛋白表达比较

各组大鼠海马脑组织NOS活性和nNOS蛋白表达水平比较见图1和表3。可知：单纯运动组(B)海马脑组织NOS活性显著低于正常对照组(A)，P<0.01。石菖蒲中，高剂量组(D、E)和α-细辛醚中，高剂量组(G、H)海马脑组织NOS活性均明显低于单纯运动组(B)，P<0.01。石菖蒲及α-细辛醚低、中、高剂量组(C、D、E或F、G、H)大鼠海马脑组织NOS活性分别依次升高，差异均有显著性，P<0.01。α-细辛醚低、中、高剂量组海马脑组织NOS活性分别与石菖蒲低、中、高剂量组比较，差异均无显著性，均P>0.05。各组大鼠海马脑组织nNOS蛋白表达水平趋势与NOS活性的变化趋势基本相同。提示石菖蒲和α-细辛醚均具有较明显的提高疲劳运动大鼠海马脑组织NOS活性和nNOS蛋白表达水平作用。

Fig. 1 nNOS protein expression in hippocampus among groups

Tab. 3 Comparison of the activities of NOS and the levels of nNOS protein expression in hippocampus among groups

3 讨论

本项研究表明:石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚能明显改善疲劳运动大鼠学习记忆和提高海马脑组织SOD和NOS活性及nNOS蛋白表达水平，降低MDA含量，并呈一定的剂量依赖性。

由疲劳运动导致机体学习记忆的下降正在引起学者们的重视[7-8]。石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)为天南星科菖蒲属植物石菖蒲的干燥根茎。改善机体的学习记忆是石菖蒲对中枢神经系统兴奋作用的重要方面[9]。α-细辛醚是我们课题组从云南产的石菖蒲中分离得到的重要活性成分。研究表明α-细辛醚能改善Fmr1基因敲除小鼠的学习记忆[10]。但有关石菖蒲及其活性成分α-细辛醚对疲劳运动大鼠学习记忆的影响及其作用机制方面的报道甚少。本项研究表明石菖蒲及其活性成分α-细辛醚能明显提高运动性疲劳大鼠的学习记忆能力，并呈一定的剂量依赖性。

众多研究表明过量运动会产生大量的自由基。自由基生成增多，打破了自由基生成和清除的动态平衡，可导致脂质、蛋白质和DNA发生过氧化，损伤细胞的结构和功能[11]。海马脑组织SOD和MDA等自由基代谢失衡与学习记忆功能下降密切相关[3]。力竭运动使脑缺血/再灌注大鼠海马区SOD活性下降，MDA含量增加，加重氧自由基损伤；并对学习记忆功能造成明显损害[12]。本项研究表明：单纯运动组大鼠海马脑组织SOD活性明显低于正常对照组，而MAD含量显著高于正常对照组。而海马又是学习记忆的关键脑区。提示疲劳运动致机体学习记忆下降与海马区自由基代谢失衡密切相关。有研究还表明石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚能明显降低疲劳大鼠海马区MDA含量，提高SOD活性，并呈一定的剂量依赖性。提示石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚阻止疲劳运动大鼠海马自由基代谢失衡，可能是其提高疲劳运动大鼠学习记忆的重要机制之一。

一氧化氮(Nitric oxide，NO)参与血压的维持、宿主防御、神经传递、抑制血小板聚集和学习记忆等多个生理过程，并涉及心血管、中枢神经和肌肉骨骼等系统的功能失调或疾病[13]。NO作为控制生理功能的重要细胞内信使，由三种不同的一氧化氮酶合成。脑组织海马区中神经型一氧化氮合酶(nNOS)是合成神经递质NO，进而参与学习记忆的关键酶[14-15]。研究表明内源性NO不但参与空间记忆的每个阶段，而且对海马突触可塑性起关键作用的ERK和CaMKII的磷酸化也有重要作用[16]。一氧化氮合成酶(NOS)或NOS激活的上游分子的破坏介导衰老过程中的学习记忆下降[17]。转人P301L突变tau 基因小鼠同时出现学习记忆障碍与全脑一氧化氮含量明显下降的现象[18]。对NOS/NO信号通路的调节能改善酒精诱导的学习记忆下降[4]。NO化学性质非常活泼, 半衰期很短, 难以直接检测，故本研究以测定NOS活性来反映组织NO含量[19]。疲劳会使脑组织中NOS活性减弱[19]。疲劳运动作为一种应激刺激,使杏仁体神经元NOS表达减少[20]。本项研究表明B组大鼠海马脑组织中NOS活性和nNOS蛋白表达显著低于A组，提示nNOS/NO信号下调可能是疲劳运动导致学习记忆下降的重要作用机制之一。有研究还表明石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚能提高疲劳运动大鼠海马nNOS蛋白表达，进而使NOS活性增强，从而改善疲劳运动大鼠的学习记忆。又研究表明石菖蒲改善学习记忆与其调节海马突触可塑性有关[21-22]。而NO又参与海马突触可塑性的调节，提示对海马nNOS/NO信号的调节可能是石菖蒲改善学习记忆的重要机制之一，有待进一步的研究。

石菖蒲和α-细辛醚改善疲劳运动大鼠学习记忆的作用基本一致，分析这可能与本实验选择的剂量有关的。因为在本研究中石菖蒲中α-细辛醚的含量约为0.05%。本文对α-细辛醚的剂量选择不是根据石菖蒲中的α-细辛醚有效含量进行选择的，而是根据药物作用的有效性和预实验的结果来进行选择的。同时也提示α-细辛醚可能是石菖蒲改善疲劳运动机体学习记忆的主要活性成分。

综上所述，疲劳运动导致的学习记忆下降与海马自由基代谢失衡, nNOS/NO信号下调有关。石菖蒲及其活性成分-α-细辛醚具有改善疲劳运动大鼠学习记忆作用，其机制与纠正海马自由基代谢失衡, 上调海马nNOS/NO信号有关。为石菖蒲在运动医学中的应用提供部分实验依据, 为新的益智药研发提供新的思路。