产气荚膜梭菌PCR 检测方法建立

贾锋军

（山东省临朐县农业农村局柳山畜牧兽医站 262616）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C.P) 又称魏氏梭菌(Cl.welchii)，首先是Welchii 与Nuttad （1982）由腐败人尸体的血管中分离到的，并以Welchii 命名[1]。因能分解肌肉和结缔组织中的糖类而产出大量气体及可以在体内能形成荚膜而得名[2]。

PCR 技术因其简单、快速、特异性强和灵敏度高的特点，自Mullis1985 年发明PCR 技术和Erlich1988 年发现耐高温的DNA 聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑[3]。本试验应用PCR 技术，通过设计并合成产气荚膜梭菌、诺维氏梭菌和腐败梭菌的特异性引物，成功扩增出了相应目的片段。成功建立起产气荚膜梭菌、诺维氏梭菌和腐败梭菌的PCR 检测方法。

1 材料

菌株：产气荚膜梭菌NCTC 528、6212、3180、8346、8084、诺维氏梭菌ATCC 27606、腐败梭菌ATCC 12464、大肠杆菌、乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢杆菌、迟缓爱德华氏菌、肺炎克雷伯氏菌；以上菌株均由山东农业大学预防兽医学环境微生物实验室保存。

2 方法

2.1 DNA 模板制备

将产气荚膜梭菌，诺维氏梭菌，腐败梭菌进行厌氧培养，大肠杆菌进行有氧培养，将所得的菌液水煮10min，12000r/min离心5min，取上清即为所需DNA 模板。

2.2 引物设计

根据GeneBank 中已上传的产气荚膜梭菌alpha 毒素基因序列，选取alpha 毒素保守区序列，设计并合成多对引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所合成引物见附表。

2.3 PCR 扩增反应体系

20 ul 反应体系：10ul 2×TSINGKE MasterMix （购自青岛擎科梓熙生物科技有限公司），8.2ul ddH2O，1ul DNA 模板，0.4ul 上游引物，0.4ul 下游引物。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃延伸30s，72℃复性30s，35 个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

2.4 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳与测序

PCR 反应结束后，取15ul 反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。对产气荚膜梭菌特异性片段进行切胶并胶回收测序。

2.5 PCR 检测的特异性、重复性试验

产气荚膜梭菌引物以腐败梭菌、诺维氏梭菌、大肠杆菌、乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢杆菌、迟缓爱德华氏菌、肺炎克雷伯氏菌为阴性对照，检测PCR 反应的特异性；多次重复以验证其重复性。

2.6 PCR 检测的临床应用

因产气荚膜梭菌病临床样品较，本实验用所设计引物对临床产气荚膜梭菌样品进行PCR 检测。

3 结果

3.1 PCR 扩增结果

利用合成的引物进行PCR 扩增，结果显示，产气荚膜梭菌在85bp （因85bp 和100bp 大小相差很小，图中显示在100bp左右）、697bp 处有明显条带。所设计的引物可以扩增出目的片段。扩增结果如图1。

3.2 PCR 检测的特异性、重复性试验

在相同情况下，产气荚膜梭菌的引物只有产气荚膜梭菌才能扩增出相应的片段，诺维氏梭菌的引物只有诺维氏梭菌才可以扩增出相应的片段，腐败梭菌引物只有腐败梭菌才可以扩增出相应的片段，如图2 显示，产气荚膜梭菌 （NCTC 528、6212、3180、8346、8084）在85bp、697bp 处有明显条带，腐败梭菌（ATCC 12464）、诺维氏梭菌（ATCC 27606）在85bp、697bp 处没有条带。用乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢杆菌、迟缓爱德华氏菌、肺炎克雷伯氏菌分别对所设计的引物进行PCR 扩增，如图3 所示，均未扩增出条带。重复性试验显示，多次重复均可扩增出相应目的条带。综上，所设计的引物特异性好、重复性好。

附表 引物合成表

图1 PCR 扩增结果电泳图

图2 PCR 扩增结果电泳图

3.3 PCR 检测的临床应用

在获得天然感染产气荚膜梭菌阳性样品，对其进行PCR 鉴定。结果显示，所设计的产气荚膜梭菌可以扩增出目的片段，如图4。所建立的PCR 可检测出阳性临床样品。

4 讨论

图3 PCR 扩增结果电泳图

图4 PCR 扩增结果电泳图

梭菌属（Clostridium）的细菌是一群可形成芽孢，且芽孢普遍大于菌体，致使菌型从杆状变为梭状的一类革兰氏阳性厌氧大肠杆菌。这属细菌有许多共同的特点：分布极其广泛，存在于腐物、土壤、人和动物肠道中，多数为腐物寄生菌，只有少数为致病菌。在致病菌的致病力上，本属菌多通过外伤感染，多数是通过细菌产生的外毒素致病，其中第1 种类型细菌侵入动物机体，与其所产生的毒素共同引起相应的疾病，如产气荚膜梭菌、水肿梭菌（诺维氏梭菌）、腐败梭菌、溶组织梭菌等；第2 种类型菌体虽然在机体内生长繁殖，但只有其所产生的毒素致病，菌体的直接致病作用很小，如破伤风梭菌；第3 种类型菌体并不侵入机体，但可在体外产生毒素，人和动物是由于摄取了被毒素污染的食物或饲料引起中毒性疾病，因此，对此类疾病的微生物学诊断既要进行细菌学检查，又要进行毒素检测，后者更为重要。腐败梭菌、产气荚膜梭菌易于动物死亡后侵入机体，诺维氏梭菌，溶血梭菌，腐败梭菌，产气荚膜梭菌等则存在于正常动物体中，由动物体内分离出这些梭菌，并不能肯定它们就是病原菌，应结合流行病学，病变及微生物学检查等综合判断。此时，细菌的毒力测定极为重要[4]。

α 毒素是A、B、C、D、E 型产气荚膜梭菌均产生的外毒素[5]，其中，A 型菌的α 毒素产量最高。目前，国内已构建了针对该菌α 毒素的双夹心ELISA 方法用来检测产气荚膜梭菌[6]。

产气荚膜梭菌α 毒素引起的疾病大多发病急、死亡快，缺乏有效的治疗途径。因此，提前进行预防，早日确诊对动物诊疗显得尤为重要。截止到目前，产气荚膜梭菌α 毒素的检测方法研究已经相当成熟，同时也获得了很好的科研成果。就目前而言，检测α 毒素的主要方法有各种类型的ELISA 方法、胶体金试纸条法、免疫印迹的方法[7]等。

本文选用产气荚膜梭菌的α 毒素部分基因片段进行基因扩增来达到对其鉴定的目的。文中所建立的PCR 检测方法是可行的，可以作为产气荚膜梭菌的检测技术及其所致疾病的诊断方法。