白蛋白结合紫杉醇腹腔灌注化疗的动物实验

叶 颖 蒋 华

作者单位：南京医科大学附属常州第二人民医院213000

腹膜癌是腹腔内肿瘤晚期患者比较常见的情况，患者一旦出现腹膜转移并发恶性腹水，是癌症终末期表现，预后极差，患者的生存期通常都不超过1年［1～3］，常规治疗主要通过反复腹腔穿刺引流以及药物灌注等，但效果不理想，不仅引起腹水增长过快，还进一步造成低蛋白血症、水电解质紊乱等情况，恶性腹腔积液的控制是肿瘤科的难题之一。另一方面，随着研究的深入，国际上对腹膜癌的认知也出现了转变，并非所有的腹膜癌均为癌症广泛转移的结果，有一部分患者为区域性癌转移，对于这些患者加强腹腔局部控制能够带来更长的生存期［4］。

在妇科恶性肿瘤中，卵巢癌是导致死亡的主要原因，其发病率仅次于宫颈癌［5］，且卵巢癌患者在腹腔灌注整个治疗体系中所占比例很大。卵巢癌早期无明显临床症状，在诊断时通常已处在晚期，卵巢癌对化疗敏感，铂类联合紫杉醇是卵巢上皮癌的一线化疗方案［6］。种植转移是最重要的转移途径，当肿瘤细胞穿透包膜时，可以广泛种植在盆腔和腹腔中，形成腹膜癌（PC）并且合并恶性腹水，在这种情况下患者的中位生存时间仅为12 ～24 月［7］，五年生存率不到20%［8］，因此卵巢癌患者腹膜癌的治疗对于改善预后、延长生存期有重要意义。美国妇科肿瘤协作组2006年在新英格兰医学期刊发表的Ⅲ期临床研究GOG172的结果显示［6］，相比静脉TP（紫杉醇联合顺铂）方案，腹腔注射（Intraperitoneal，IP）组无进展生存期（PFS）提高了5个月（18.3月vs.23.8月，P＝0.05），总生存期提高了近16个月（49.7月vs.65.6月，P＝0.03），这个结果引起了临床专家的关注，随后开展了一系列有关卵巢癌腹腔灌注化疗的相关研究。随着腹腔灌注技术的发展，腹腔热灌注化疗（HIPEC）逐渐运用于临床恶性腹水的治疗，HIPEC在复发性卵巢癌中的研究目前仅限于单一机构的经验和回顾性研究，尽管多数研究结果都支持HIPEC，但是缺少大型前瞻性Ⅲ期临床研究结果支撑［9］。

目前腹腔局部治疗主要集中在药物治疗和HIPEC上，尽管研究很多，但是还是存在很多问题，例如：新型纳米紫杉药物在很多肿瘤治疗中已经被证明比传统紫杉醇和多西紫杉醇疗效更好，那么在腹腔内用药是否也更优？已有研究表明一种掺入了紫杉醇的聚合物胶束纳米颗粒NK105在腹腔内使用时，与IP紫杉醇相比具有明显更大的抗肿瘤作用［10］，那么临床应用更广泛的纳米白蛋白紫杉醇是否也同样更好？近年来抗血管生成药物在临床应用越来越多，有研究证明这类药同样对胸腹水的控制有良好效果，与化疗药联合应用能否更好地局部控制也是令人感兴趣的话题。本研究主要在动物实验中探索了不同紫杉类药物腹腔内灌注的疗效区别，以及与抗血管生成药物联合应用结果。

1.材料和方法

1.1 实验材料 裸鼠70只雌性BALB／c裸鼠，体重18～22g，4～5周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物生产许可证：SCXK（沪）2017-0006，合格证编号：2015000561673；实验动物使用许可证：SYXK（苏）2017-0015。根据实验动物护理指南维护并照顾所有动物，饲养于裸鼠专用塑料笼中，并置于隔离房内饲养，环境温度为26℃，湿度为70%，每天光照12小时。细胞系：ES-2系（人卵巢癌细胞）购自江苏凯基生物技术有限公司，将细胞培养在含有10%FBS［Biological Industries（BI）胎牛血清购于北京沃比森科技有限公司］和青霉素／链霉素的McCoy's 5A培养基中，并于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养，定期传代细胞以维持指数生长。化疗药物：顺铂购自齐鲁制药有限公司，紫杉醇购自长江制药集团，白蛋白紫杉醇购自恒瑞医药有限公司，安维汀购自上海罗氏制药有限公司，恩度购于先声药业，所有药物均于4℃保存，加入生理盐水中调配置实验所需的药物浓度。无菌条件下向所有裸鼠腹腔内注射0.2ml含有2×106个的ES-2细胞的PBS细胞悬液，接种后观察腹部膨胀程度，注射后约8天裸鼠出现腹部鼓胀，B超检查可见液体暗区，这意味着腹水形成，卵巢癌裸鼠腹水模型构建成功。

1.2 实验设计 接种24小时后，将裸鼠随机分成7组，除空白对照组外，其余实验组裸鼠分别在种瘤后的第8天、11天和14天注射实验药物。分组和剂量如下：空白组（Blank）正常喂养，未经任何处理；生理盐水对照组（Control）注射化疗组相同体积的生理盐水（NS）；顺铂组（DDP）注射顺铂（10mg／kg）；紫杉醇组（PTX）注射紫杉醇（10mg／kg）；白蛋白紫杉醇组（Nab-PTX）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）；白紫＋安维汀组（NP＋Ava）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）＋ 安维汀（5mg／kg）；白紫＋恩度组（NP ＋Endo）注射白蛋白紫杉醇（10mg／kg）＋恩度（5mg／kg）。实验期间正常喂养所有裸鼠。观察指标：①每天测量裸鼠腹围、体重。②观察裸鼠的一般情况，如进食和腹泻等。③给药前和全部给药结束后（第15天）抽取裸鼠尾静脉血行血常规检测。④记录所有裸鼠死亡情况，实验期间裸鼠正常喂养直至自然死亡，观察腹水的颜色。

1.3 统计学方法 统计结果表示为平均值，所有统计分析均使用SPSS 23.0进行，用t检验比较两组之间的统计学差异。三组或更多组的变量通过单因素方差分析比较。P＜0.05时认为差异显著，有统计学意义。

2.结果

2.1 裸鼠腹水控制情况 实验中由于第8天起裸鼠腹水明显增多，所以选择第8天进行第一次腹腔注射化疗药物。（1）单药组（顺铂组、紫杉醇组、白蛋白紫杉醇组）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：所有实验组裸鼠腹围增加缓慢，与对照组相比差异有统计学意义（P9th＜0.05），各实验组之间腹围差异均无统计学差异（P＞0.05），可见所有化疗药物均可抑制腹水增长。②第二次腹腔灌注后（第12天）：白蛋白紫杉醇组裸鼠腹围明显低于顺铂组和紫杉醇组（P＝0.012，P＝0.007）。③第三次腹腔注射后（第15天）：裸鼠腹围达到最低点，白蛋白紫杉醇组与顺铂、紫杉醇组的差异持续存在并有统计学意义，白蛋白紫杉醇组对腹水控制效果更佳且持续时间更长。（2）联合用药组（白蛋白紫杉醇＋安维汀，白蛋白紫杉醇＋恩度）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：与各单药组之间差异无统计学意义。②第二次腹腔灌注后（第12天）：与单药顺铂组、紫杉醇组相比有统计学差异（P＜0.01），与单药白蛋白紫杉醇、以及两组联合用药中尚未出现统计学差异。③第三次腹腔注射后（第15天）：白蛋白紫杉醇＋安维汀比单药白紫组对腹水的抑制效果更强（P＜0.01），白蛋白紫杉醇＋恩度与单药白紫组差异无统计学意义，可见白蛋白紫杉醇联合安维汀对腹水的抑制程度更优于单药白蛋白紫杉醇组，而白蛋白紫杉醇联合恩度对腹水的控制情况较单药白紫无明显优势。见图1。

图1 所有裸鼠在25天内的腹围均值的变化

图2 所有裸鼠在25天内体重均值的变化

2.2 裸鼠体重变化情况 裸鼠体重变化与腹围变化相对一致，体重可从另一侧面反映药物对裸鼠腹水的抑制情况。（1）单药组（顺铂组、紫杉醇组、白蛋白紫杉醇组）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：所有实验组裸鼠体重增加缓慢，各实验组之间无差异（P＞0.05）。②第二次腹腔灌注后（第12天）：白蛋白紫杉醇组裸鼠体重低于顺铂组和紫杉醇组（P＜0.01）。③第三次腹腔注射后（第15天）：各组裸鼠体重达到最低点，白蛋白紫杉醇组与顺铂、紫杉醇组的差异持续存在并有统计学意义。（2）联合用药组（白蛋白紫杉醇＋安维汀，白蛋白紫杉醇＋恩度）：①第一次腹腔灌注后（第9天）：各组之间尚未出现差异。②第二次腹腔灌注后（第12天）：与单药白蛋白紫杉醇组、白蛋白紫杉醇＋恩度联合组相比均无统计学差异（P＞0.05）。③第三次腹腔注射后（第15天）：白蛋白紫杉醇＋安维汀组体重抑制最为明显，与联合恩度组及单药白紫组均有统计学差异（P＝0.02，P＝0.03），且低于空白组。由于体重可能受到化疗药物的毒副反应、肿瘤消耗的影响，不能完全认为是药物疗效，还需进一步评估联合用药是否增加不良反应。见图2。

2.3 裸鼠生存时间分析 实验期间所有裸鼠均正常喂养，直至自然死亡，记录每只裸鼠的存活时间（见表1）。裸鼠死亡时解剖发现腹水均为淡黄色。

2.4 各组裸鼠生存曲线分析 （1）单药组（图3A、B、C）：与对照组、顺铂和紫杉醇组相比，白蛋白紫杉醇可以延长腹水控制时间（PA＝0.00，PB＝0.012，PC＝0.014），这意味着白蛋白紫杉醇可有效控制腹水并延长卵巢癌裸鼠的寿命。（2）联合用药组（图3D、E）结果显示白蛋白紫杉醇联合抗血管生成药物较对照组来说，可延长裸鼠的存活时间，但与单药白蛋白紫杉醇相比差异无统计学意义（PE＝0.078），可认为相比单药白蛋白紫杉醇，联合抗血管生成药物并没有更加延长裸鼠存活时间的优势，而在联合恩度组中裸鼠总生存时间较单药白紫有缩短的趋势，联合用药可能会增加药物毒副反应从而造成裸鼠生存时间变短，这需要进一步对药物剂量的选择进行摸索。

表1 所有裸鼠总存活时间 单位：天

图3 各组裸鼠生存曲线比较

2.5 药物不良反应 在药物灌注前以及药物灌注后分别抽取裸鼠尾静脉血2次，分别进行血常规检测，通过观察白细胞、血红蛋白、血小板的抑制程度评估每种实验药物的骨髓抑制情况。结果显示，各组化疗药物均可造成裸鼠的白细胞、血红蛋白和血小板下降，但各组之间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。这意味着各化疗单药及联合用药在裸鼠骨髓的造血细胞中骨髓抑制作用相似，暂无加重骨髓抑制程度的证据，见表2。

3.结论

在腹腔灌注单药对比中，证实腹腔注射白蛋白紫杉醇是抑制晚期卵巢恶性腹水的有效策略，局部腹水控制时间和总生存时间优于顺铂或紫杉醇。副作用方面，顺铂、紫杉醇和白蛋白紫杉醇三组实验组的骨髓抑制程度相似，差异无统计学意义，可认为腹腔灌注白蛋白紫杉醇相比顺铂和紫杉醇并未增加局部化疗的不良反应。白蛋白紫杉醇联合安维汀与单药白蛋白紫杉醇相比，能够更加有效地控制腹水，有延长裸鼠总生存时间的趋势。

表2 给药前后裸鼠白细胞、血红蛋白、血小板的平均值变化

该结果为腹腔灌注白蛋白紫杉醇腹腔灌注治疗卵巢癌腹水奠定了基础，这是首次腹腔内使用单药白蛋白紫杉醇治疗的实验研究，对白蛋白结合型紫杉醇运用于临床HIPEC，为卵巢癌腹水患者提供了更多腹腔灌注的药物选择有重要的临床意义。必须进行更多的动物研究和临床试验，以提高卵巢癌患者腹水治疗的有效性和安全性。

4.讨论

卵巢癌患者即使在行满意的细胞灭减术（CRS）之后仍可能在腹腔内残留大量游离癌细胞或小病灶，这部分残留的肿瘤病灶既不能被手术完全切除也无法通过全身静脉化疗获得很好的疗效，这使得约60%的卵巢癌患者最终死于腹腔内的肿瘤复发［11］。卵巢癌病灶通常局限于腹腔内，正因为如此卵巢癌患者进行腹腔内化疗具有很强的理论基础［12］。腹腔热灌注化疗是一种肿瘤局部治疗方法，在各种原发或继发腹膜癌的治疗中有较好疗效，HIPEC可将缺乏血管的肿瘤组织和游离的肿瘤细胞暴露于高浓度的化疗药物中，同时由于血液-腹膜屏障的存在，化疗药物局限于腹腔内很难进入血液循环，从而减少化疗全身副反应。完整细胞灭减数后的HIPEC在腹膜转移的卵巢癌患者的治疗中产生了令人满意的效果［13，14］，不仅可以延长中位PFS和中位OS，还可降低死亡风险。

铂类联合紫杉醇全身静脉化疗方案是晚期上皮性卵巢癌患者的一线治疗方案，因此在卵巢癌腹水患者的HIPEC中仍然延续使用铂类和紫杉醇。国内外研究中，顺铂是卵巢癌腹膜转移患者最常用的腹腔化疗药物，但存在比较严重的不良反应，因此其他药物用于腹腔热灌注化疗也在进行疗效的验证［14］。紫杉醇是抗细胞内微管化疗药物，通过特异性结合在小管J3位上，使微管蛋白出现聚合反应，抑制微管蛋白自身解聚功能，这将影响细胞在有丝分裂时期纺锤体结构的生成，最终阻碍肿瘤细胞繁殖与分裂。相比顺铂，紫杉醇穿透腹膜的能力极其有限，几乎不到1mm，腹膜吸收率明显降低［15］。这表明腹腔灌注紫杉醇适用于腹腔微转移患者，且通过体外实验已证实紫杉醇能够增加抗肿瘤作用，同时可明显降低全身毒性反应［16］，GOG172Ⅲ期临床研究的结果显示，相比静脉TP（紫杉醇联合顺铂）方案，IP紫杉醇可有效提高患者的PFS及OS。由此可见，紫杉醇类药物在卵巢癌患者的HIPEC中有良好的疗效。

随着紫杉醇新剂型的不断研发，Nab-PTX广泛用于晚期卵巢癌患者的全身化疗，并被认为是一种低毒高效的新型紫杉类剂型［17］。Nab-PTX通过纳米技术将紫杉醇与人血白蛋白结合在一起，形成大小约130nm的复合物颗粒。白蛋白在体内的主要生理功能是运输营养元素，肿瘤细胞的特征是较正常细胞更快的增殖和分化，因此肿瘤细胞需要更多地供能，也就更容易富集白蛋白。肿瘤血管内皮细胞中的大量GP60受体在EPR效应后被激活（白蛋白紫杉醇可通过细胞间连接泄漏），形成的Nab-PTX-GP60复合物可靶向结合SPARC（分泌蛋白，酸性和富含由肿瘤细胞分泌的半胱氨酸）。最后，新的复合物形成，并通过非溶酶体机制到达肿瘤组织肿瘤细胞中［18］。这些特征意味着肿瘤细胞需要更多的营养物质，这有助于结合更多的白蛋白紫杉醇，从而增加紫杉醇药物的局部浓度。有文献表明相比CRE-紫杉醇（CremophorEL紫杉醇是紫杉醇注射液），Nab-PTX能够更好地渗入腹壁，且Nab-PTX的腹膜聚集浓度是传统紫杉醇制剂的5倍。Nab-PTX不仅有更好的穿透效果，更高的腹膜组织浓度，同时全身血药浓度低［19］。白蛋白紫杉醇的这些特征增加了紫杉醇在肿瘤组织中的浓度，且全身毒副反应小［19，20］。Neil D等人研究证实，等毒性剂量下应用白紫较传统紫杉醇的裸鼠无瘤生存期长，复发时间较长，肿瘤倍增时间短［21］。

Nab-PTX在多种恶性肿瘤的化疗中均有良好疗效，但在腹腔灌注中尚无研究证实其疗效及安全性。Federico Coccoli-ni［19］等人将Nab-PTX运用于兔子腹腔灌注中，仅证实其相较于传统紫杉醇制剂能够更好地渗入腹壁并增加腹膜聚集程度，该研究能够一定程度上证实Nab-PTX在腹腔灌注中的可行性，由于该实验中的动物并未构建动物腹水模型，因此腹腔灌注Nab-PTX对腹水的抑制程度和安全性仍不可知。因此在我们的研究中构建了裸鼠卵巢癌腹水模型，为了进一步探索Nab-PTX单药以及联合抗血管生成药物在腹腔灌注中是否同样有良好的疗效及安全性，在本研究中将顺铂、紫杉醇、白蛋白紫杉醇作为单药组，对裸鼠腹水的控制情况及生存期进行比较。并在联合用药组将安维汀、恩度两种抗血管生成药物与白蛋白紫杉醇联合使用，以观察抗血管生成药物的加入是否能在单药的基础上增加疗效及生存时间。

结果证实白蛋白紫杉醇组的腹水局部控制时间比其他实验组更长。另外，通过对生存曲线的分析，我们发现白蛋白紫杉醇可以延长裸鼠的总存活时间。本研究是探索将白蛋白紫杉醇用于控制恶性腹水的第一个动物实验，动物实验最初设计是在处死裸鼠后观察腹膜和肝脏转移情况，然而在实验过程中所有死亡裸鼠均未见腹膜及肝脏转移的实体肿瘤病灶。实验过程中一部分实验裸鼠没有完全接受所有三次的腹膜内药物灌注，由于这部分裸鼠在第12天即开始出现死亡。这提示我们白蛋白紫杉醇用于腹腔灌注时的适当剂量需要进一步探索。