10个观赏海棠品种叶片春季色彩变化及其与色素含量的相关性

韩文学，江皓，卞健，云金虎，孙艳艳，张往祥,4，彭冶*

（1.南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京210037；2.南京林业大学生物与环境学院，南京210037；3.南京林业大学林学院，南京210037；4.扬州小苹果园艺有限公司，江苏 扬州225200）

海棠（Malusspp.）是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（MalusMill.）中的一类观赏植物，被广泛地应用于园林造景中，在全世界的品种数量为700多个[1]。源自北美的观赏海棠品种不仅花色艳丽，其新叶色彩也有一定的观赏性；不同品种观赏期不同，长的达40 d，短的也有15 d 左右[2]。近年来，北美观赏海棠被大量引入我国，学者们对其不同品种的花色、叶色等进行了研究。如：张往祥等[3-4]对观赏海棠品种花色动态变化及色素组分动态特征进行了研究，揭示了花色变化过程中色素含量的动态变化特征。姜文龙等[5-6]根据叶片在枝条上的不同叶位，研究了观赏海棠品种叶片色彩特征及色素含量差异，系统区划了品种群，探究了不同品种群叶位间叶片色彩及色素含量的区别。此外，张洋等[7]和张曼等[8]从大尺度的视角观察了不同品种观赏海棠叶片色彩变化，发现在叶片发育初期色彩最为丰富，随着叶片成熟叶色最终趋于一致。尽管前人从不同角度研究了观赏海棠丰富多彩的叶色，但针对观赏海棠叶片在春季展叶期间的叶色变化规律，以及色素含量对色彩影响的研究还不多见。因此，本研究以10个展叶期叶片呈红色、引自北美观花海棠品种作为试验材料，利用色差计对同一枝条上处于不同阶段（展叶前期L1、展叶初期L2、展叶后期L3）的叶片，进行了色彩参数明度（lightness,L*）、红度（redness,a*）、黄度（yellowness,b*）值的测定和分析，并初步建立了这10 个观赏海棠品种叶片的色彩图谱；此外，通过测定不同发育阶段叶片中叶绿素、花青素和类胡萝卜素的含量，并与色彩参数进行相关性分析，以揭示色素含量对观赏海棠叶色变化的影响，进而为观赏海棠种质资源的深入开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019 年4 月初，于江苏省扬州市江都区仙女镇国家海棠种质资源圃，选择10 个展叶期叶片呈红色、引自北美的观赏海棠品种，取其2～3 年生苗为试验材料，品种名见表1。每个品种选择生长健壮且同一生长环境的植株50～70株。

1.2 试验叶片的选择

依据每个品种的物候期，展叶15 d 后，从当年抽生未木质化的枝条上采摘叶片（长度30 cm 左右）。采摘时，选择同一枝条上不同发育时期的叶片（图1）：展叶前期（L1）叶，即新梢上的未展叶；展叶初期（L2）叶，即新梢下第2—3 片叶；展叶后期（L3）叶，即第4—5片叶。采摘的叶片一部分用于叶色参数的测定，另一部分立即放于冰盒中带回实验室，于－80 ℃冰箱中保存，用于叶绿素、类胡萝卜素和花青素含量的测定。所有样品均设置3个重复。

表1 供试观赏海棠品种Table 1 Ornamental crabapple varieties tested

1.3 色彩及色素含量测定方法

利用美国爱色丽便携式色差仪X-Rite Ci60 对待测叶片的叶色进行测定。测定时，选用内置D65光源，测量孔径4 mm，于室内操作，以排除外界光源的干扰。选取每个叶片上与叶脉对称的6个点进行测定，记录色彩参数明度（L*）、红度（a*）、黄度（b*），其中：L*为垂直轴，表示色彩明亮度，其值为0（白）～100（黑）；a*为横轴，表示红绿色相，红色相为＋a*，绿色相为－a*；b*为纵轴，表示黄蓝色相，黄色相为＋b*，蓝色相为－b*[9]。利用色彩参数（L*、a*、b*）绘制色彩图谱。

叶绿素和类胡萝卜素含量测定采用丙酮-乙醇等量混合浸提法[10]，以SPECORD 200 PLUS 型分光光度计在470、649和665 nm波长下测定吸光度值。花青素含量测定采用2%盐酸-甲醇浸提法[11]，以SPECORD 200 PLUS 型分光光度计在530、653 nm波长下测定吸光度值。

1.4 数据处理

利用Excel 2016 对原始数据进行初步整理，然后使用GraphPad Prism 7绘制柱状图和用统计软件SPSS 21.0进行相关性和显著性分析，并运用Adobe Photoshop CC 2015.5绘制色彩图谱。

2 结果

2.1 不同发育时期观赏海棠叶片色彩变化规律

从图2A 中可知，不同观赏海棠品种随着发育时期的变化，叶片的明度L*整体变化幅度不大。其中：‘丰盛’‘高原红’‘皇家雨点’‘时光秀’‘硕红’‘完美紫’‘紫王子’7 个品种叶色明度稳定性较好；仅‘鲁道夫’1 个品种叶色明度呈梯度降低，稳定性最差（P＜0.05）；‘黛玉’‘粉冠’2个品种叶色明度呈显著增加趋势。

从图2B 中可知，10 个观赏海棠品种叶片红绿色相a*值的变化呈现不同的趋势。其中：‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘鲁道夫’‘硕红’‘完美紫’‘紫王子’7 个品种的a*值呈显著降低趋势（P＜0.05），即叶片红色程度逐渐减弱，绿色程度逐渐增强，且‘黛玉’和‘硕红’的a*值最终为负，即叶片呈绿色。而‘高原红’‘皇家雨点’‘时光秀’3 个品种的a*值呈增高趋势，即这3 个品种叶片色彩的红色程度强于其他品种，其呈红色周期长，达35 d左右，观赏价值较高，并且‘高原红’在3个发育时期中，叶色持续变红，增长趋势明显（P＜0.05），可作为最优的观叶品种进行培育改良。

图1 叶片发育时期Fig.1 Leaf developmental stages

从图2C 中可知，10 个观赏海棠品种叶片色彩黄蓝色相b*值随着发育时期的变化增长趋势明显（P＜0.05），即10 个观赏海棠品种叶片色彩呈黄色程度逐渐增强。

2.2 10 个观赏海棠品种叶片色彩图谱

同一发育时期，不同品种间色彩参数存在显著性差异，即叶片呈现的色彩也不同。结合图2和图3对10个观赏海棠品种叶片色彩特性进行分析，结果发现：在3个发育时期，10个观赏海棠叶片明度L*值变化不大，所以，主要对红绿色相a*和黄蓝色相b*值进行分析。

在L1时期，10 个观赏海棠叶片主色调均为红色，色彩最为丰富。‘鲁道夫’色彩参数a*、b*值最大（a*=12.33，b*=9.58），色彩鲜艳醒目，‘硕红’色彩参数a*值最小（1.62），b*值仅次于‘鲁道夫’，叶色观赏特性远不及‘鲁道夫’，表明红绿色相a*值可作为观赏海棠观叶特征的主要指示值，黄绿色相b*值是观赏海棠叶色变化的辅助指示值。

在L2时期，‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘硕红’4 个品种叶片红绿色相a*值在1.20～5.54 之间，黄绿色相b*值在7.95～16.20 之间，且随着发育时期的变化，b*值的增加量大于a*值的减少量，即叶片的红色渐退，呈现黄绿色。‘高原红’‘皇家雨点’‘鲁道夫’‘时光秀’‘硕红’‘完美紫’‘紫王子’6 个品种的a*值在7.04～9.52之间，b*值在4.61～12.50之间，且随着发育时期的变化，b*值的增加量小于a*值的减少量，其叶片仍以红色为主。

在L3时期，‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘硕红’4 个品种红绿色相a*值在－6.83～2.75之间，黄绿色相b*值在12.70～21.02之间，即a*值较低，b*值较高，叶片色彩泛绿。在3 个发育时期中，这4 个观赏海棠品种叶片色彩红色周期短，为15 d左右，叶片较早转绿，观赏价值较低。相反，‘高原红’‘皇家雨点’‘时光秀’3 个品种a*值在6.28～9.57 之间，b*值在6.14～8.36 之间；在3 个发育时期中，其叶片红色周期长，可达35 d 左右，观赏价值较高。而‘鲁道夫’‘完美紫’‘紫王子’3 个品种红绿色相a*值范围为4.97～6.44，黄绿色相b*值范围为7.44～13.56，红色周期为25 d左右，观赏价值次之。

2.3 10 个观赏海棠品种色素含量变化特征

图2 不同发育时期观赏海棠叶片色彩参数分析Fig.2 Analysis of leaf color parameters of ornamental crabapple at different developmental stages

图3 10个观赏海棠品种叶片色彩图谱Fig.3 Leaf color maps of 10 ornamental crabapple varieties

从图4A～C 中可以看出：在10 个观赏海棠品种叶片中，叶绿素所占权重最大，随发育时期的变化，叶绿素含量逐渐增大，在3 个发育时期中，其占权 重 分 别 为（61.04±6.57）% 、（70.23±4.97）% 、（75.33±6.34）%。花青素所占权重次之，但随发育时期的变化逐渐减小，在3个发育时期中，其占权重分 别 为（25.87±7.77）%、（16.29±6.22）%、（11.51±7.60）%。类胡萝卜素所占权重最小，随发育时期的变化其值比较稳定，在3个发育时期中，其占权重分别 为（13.10±1.74）% 、（13.48±1.82）% 、（13.16±1.50）%。以上结果表明，无论观赏海棠展叶期叶片色素含量如何变化，其叶绿素含量所占权重均高于花青素、类胡萝卜素含量所占权重。结合图谱（图3）中叶片色彩转绿最为明显的‘黛玉’‘丰盛’‘粉冠’‘硕红’4个品种进行分析发现：随着发育时期的变化，叶绿素权重显著增大，从61.03%上升到81.88%；花青素权重显著减小，从25.40%下降到3.18%；类胡萝卜素权重呈不规律变化。表明观赏海棠叶色转绿主要受花青素和叶绿素含量变化的影响。

从图4D中可以看出，10个观赏海棠叶片叶绿素含量的变化随发育时期均呈上升趋势。其中，‘完美紫’的叶绿素质量分数在3个发育时期中均最高，为1.35～2.10 mg/g，‘黛玉’叶绿素质量分数在3 个发育时期中均最低，为0.43～1.39 mg/g，但‘黛玉’叶色在整个发育过程中较‘完美紫’绿，表明叶片的绿色并不是由叶绿素含量多少直接决定的。

从图4E 中可以看出，10 个观赏海棠叶片花青素含量随发育时期的变化均呈不同变化趋势。‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘鲁道夫’‘硕红’‘完美紫’‘紫王子’7 个品种叶片中花青素含量随发育时期逐步降低。而‘高原红’‘皇家雨点’‘时光秀’3 个品种叶片中花青素含量随发育时期逐渐增大，且这3 个品种的花青素权重变化幅度较其他品种小，范围分别为36.85%～25.07%、33.35%～22.82%和24.41%～18.59%，其叶片较其他品种红色程度强，即这3个品种可作为优质的红叶海棠而被开发利用。

从图4F中可以看出，10个观赏海棠叶片类胡萝卜素含量的变化随发育时期呈上升趋势，不同品种间类胡萝卜素含量相差不大：在L1时期10个品种类胡萝卜素质量分数均值为（0.16±0.06）mg/g，在L2时期均值为（0.26±0.04）mg/g，在L3时期为（0.31±0.03）mg/g，并且在这3 大色素中，类胡萝卜素所占权重最小。

2.4 观赏海棠叶色参数与色素含量的相关性分析

为探究在3个发育时期中观赏海棠叶片色素含量变化对叶片色彩的影响，对10个观赏海棠叶片色彩参数与叶绿素、花青素、类胡萝卜素含量进行相关性分析。由表2 可知，10 个观赏海棠品种叶绿素含量与叶片黄蓝色相b*值呈正相关，除‘完美紫’和‘紫王子’2个品种外，其他8个品种的叶绿素含量与叶片b*值呈极显著正相关（P＜0.01）。‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘鲁道夫’‘硕红’5个品种叶绿素含量与a*值呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）负相关，而其他5个品种叶绿素含量与a*值呈显著或不显著正相关。即10 个观赏海棠叶片叶绿素含量对黄蓝色有正向影响，而对叶片红绿色因品种的差异存在不同的影响。

10 个观赏海棠品种花青素含量与叶片红绿色相a*值呈显著或极显著正相关：‘紫王子’‘硕红’2个品种的花青素含量与a*值呈显著正相关（P＜0.05）；‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘高原红’‘皇家雨点’‘鲁道夫’‘时光秀’‘完美紫’8个品种的花青素含量与叶片a*值呈极显著正相关（P＜0.01），即花青素含量越高，红绿色相a*值越大，叶片红色程度越高。而花青素含量与叶片色彩明亮度L*值的相关性因品种而不同：‘黛玉’‘皇家雨点’与L*值呈极显著负相关（P＜0.01），而‘粉冠’与其呈显著负相关（P＜0.05）；‘鲁道夫’‘时光秀’与L*值呈极显著正相关（P＜0.01），其他品种与L*值不存在显著相关性。花青素含量与叶片黄蓝色相b*值的相关性同样因品种而不同：‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘鲁道夫’‘硕红’‘完美紫’6 个品种与b*值呈极显著负相关（P＜0.01），‘紫王子’‘时光秀’2个品种与其呈负相关（P＞0.05）；‘高原红’‘皇家雨点’2 个品种与b*值呈极显著正相关（P＜0.01）。即10个观赏海棠叶片红绿色的变化受到花青素含量的影响，花青素含量越高叶片越红。

图4 10个观赏海棠品种叶绿素含量动态变化Fig.4 Dynamic changes of chlorophyll contents in 10 ornamental crabapple varieties

10 个观赏海棠品种类胡萝卜素含量与叶片黄蓝色相b*值均呈极显著正相关（P＜0.01），即类胡萝卜素含量越高，黄蓝色相b*值越大，叶片越黄。而胡萝卜素含量与色彩明亮度L*值的相关性因品种而不同：‘黛玉’‘粉冠’‘高原红’‘时光秀’‘硕红’这5 个品种与L*值呈正相关，且‘黛玉’‘粉冠’与其呈极显著正相关（P＜0.01）；其他5 个品种与L*值呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）负相关。类胡萝卜素含量与红绿色相a*值的相关性也因品种而不同：‘黛玉’‘丰盛’‘鲁道夫’‘硕红’‘完美紫’这5 个品种与a*值呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）负相关；而‘高原红’‘皇家雨点’2个品种与a*值呈极显著正相关（P＜0.01）。综上所述，10 种观赏海棠叶片黄蓝色受类胡萝卜素含量的影响。

表2 观赏海棠叶片色彩参数与色素含量变化的相关性Table 2 Correlation between color parameters and pigment contents in leaves of ornamental crabapple

3 讨论与结论

3.1 10 个观赏海棠品种叶片色彩变化特征

为挖掘春季具有较长观赏期的观叶海棠品种，本文采用基于量化的色彩参数对所观察的10 个观赏海棠品种叶色进行了研究，结果发现：随着叶片的生长发育，各品种间叶片色彩均由红色转变为绿色，而品种间色彩由红变绿的快慢存在差异。这与姜文龙等[6]、张洋等[7]、张曼等[8]的研究结果一致。

色彩图谱可更具体、直观地展现观赏海棠叶片的颜色特征。结合10 个观赏海棠品种叶片的色彩图谱，从观红叶的角度分析，‘黛玉’‘粉冠’‘丰盛’‘硕红’品种的叶片色彩呈红色周期短，为15 d 左右，且较早泛绿，不适合观红叶。‘高原红’‘皇家雨点’‘时光秀’3 个品种的叶片呈红色周期长，可达35 d 左右，具较高的观赏价值。相比较于‘鲁道夫’‘完美紫’‘紫王子’3个广泛应用的观红叶品种，在3个发育时期中，‘高原红’叶片叶色持续为红色，叶红期长于‘鲁道夫’‘完美紫’和‘紫王子’，表现出较高的潜在观红叶价值。

3.2 10个观赏海棠品种色素含量对色彩变化的影响

观赏植物叶片色彩渐变的现象普遍存在，如红枫、红叶石楠、红花檵木、紫叶李等[12-15]的叶片。叶片色彩的变化主要受色素含量的影响，引自北美的观花海棠品种也存在这种现象，随着发育期的进行，叶片由初期的红色或紫色渐变为绿色。本研究测定了3 个发育时期不同观赏海棠品种叶片叶绿素、花青素、类胡萝卜素的含量，发现各品种中叶片叶绿素含量所占权重最高，并随发育时期的变化叶绿素含量逐渐增加，表明叶绿素是决定观赏海棠叶片基调色的色素。这与姜文龙等[6]的研究结果一致。齐睿等[13]的研究也表明，在红叶石楠叶片色彩变化中，叶绿素是呈色的基调色素，这也解释了叶片为何最终呈现绿色。同时，转绿较快的叶片中花青素含量急剧下降，而叶绿素和类胡萝卜素含量呈增加趋势，这解释了不同品种间色彩转绿有快有慢的原因。

对叶绿素、花青素、类胡萝卜素的含量与叶片色彩参数进行相关性分析发现，叶绿素含量与色彩参数L*、a*和b*值的相关性因品种而异，即叶绿素含量变化对观赏海棠叶色的影响并非存在绝对性。而花青素含量与叶片红绿色相a*值呈显著或极显著正相关，这与齐睿等[13]对红叶石楠叶色的研究结果一致，即花青素含量的变化决定叶片红绿色的快慢转变。朱书香等[16]研究了紫叶李、紫叶矮樱、黑杆樱李和美人梅4 种彩叶植物叶色和色素的关系，发现花青素含量与红绿色相a*值呈显著正相关。在本研究中，类胡萝卜素含量与10 个观赏海棠黄蓝色相b*值均呈显著正相关，即观赏海棠叶片中类胡萝卜素含量对叶色的黄蓝色转化速度有决定性影响。

3.3 观赏海棠叶片色彩改良策略

我国是海棠资源分布中心[17]，海棠栽培历史悠久，在18 世纪时中国海棠被引入欧美等国家，通过反复杂交和选育，他们培育出了大量观赏价值极高的品种。有学者利用分子标记手段对欧美观赏海棠的亲本进行追溯，结果表明，观赏海棠的亲本主要是亚洲山荆子[Malus Baccata(L.) Borkh.]、苹果（Malus pumila）、三叶海棠（Malus sieboldii）、楸子（Malus prunifolia）、新疆红肉苹果（Malus pumila‘Niedzwetzkyana’）等[17]。周婷等[1]对海棠品种的亲本进行追溯，发现本研究中的‘粉冠’和‘紫王子’都是由新疆红肉苹果杂交而来的。董聚苗[18]基于简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）标记法将70份观赏海棠种质分为3类，发现‘高原红’和‘皇家雨点’亲缘关系相近，‘完美紫’‘紫王子’‘粉冠’‘丰盛’亲缘关系相近，遗传性状表现相似；本研究分析叶片色彩变化的结果与此一致，‘高原红’和‘皇家雨点’叶片由红变绿存在共性，叶片呈红色周期都为35 d左右，‘完美紫’‘紫王子’‘粉冠’‘丰盛’叶片呈红色周期仅为25 d 左右。张往祥等[4]研究表明，北美园艺家对海棠花色的杂交选育主要通过提高花青素含量来实现，以提高其观赏价值。而本研究的10个北美观赏海棠叶片的花青素含量较高，可能因为在选育高花青素含量的观花品种时，其叶片中花青素含量也相应提高，从而提高了其叶片的观赏特性。