藏茶茶褐素组分特征及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的比较

陈智雄，谭礼强，张钰玉，胥伟，赵许朋，谢文钢,，刘阳，刘燕

（1.贵阳学院生物与环境工程学院，贵阳550005；2.四川农业大学园艺学院，成都611130）

藏茶是黑茶类的典型产品，是藏族同胞的民生之茶，按历史时期和各地风俗不同又称大茶、马茶、乌茶、南路边茶等[1]。藏族同胞饮茶历史上千年，其传统饮茶体验认为，藏茶具有消食解腻、调理肠胃、改善代谢等功效，加之汤色红浓明亮、陈香显著、滋味醇和回甘，藏茶近年来被越来越多的都市消费者所接受，并逐渐形成藏茶内销和藏茶汉饮的市场新趋势。因此，利用现代研究手段围绕藏茶的品质成分和活性机制开展系统研究具有实际应用价值和理论意义[2-3]。

茶褐素（theabrownines, TBs）是藏茶等黑茶产品加工过程中由多酚类物质氧化聚合成的一类化学结构复杂的水溶性褐色色素[4]。研究表明，茶褐素含量与黑茶品质呈显著正相关，且对机体具有一定的生理调节作用，被誉为普洱茶中的“软黄金”[5-6]。由于茶褐素的结构和成分的复杂性，目前对其分离纯化和活性机制的深入研究尚在起步阶段[6-7]，且大多集中在普洱茶方面[8-10]。然而，黑茶加工过程中的渥堆条件、微生物种群、发酵方法及原料等因素都会对茶褐素的形成及化学组成产生显著影响[11-13]，这不仅能解释不同黑茶茶褐素在活性功能方面的差异[6,14]，也进一步体现了探究藏茶茶褐素组成及活性的必要性和意义。

藏族同胞常年居住在高海拔地区，强紫外线和缺氧易造成其体内自由基增加及机体损伤。藏茶作为他们的生活必需品，其在清除自由基和抗氧化方面的研究[15-16]还不够深入，而关于藏茶茶褐素清除自由基能力的研究尚未见报道。因此，本文通过膜分离技术对藏茶茶褐素按不同分子质量大小进行分级制备，然后对分离得到的各组分进行光谱学特征、理化性质和微观结构分析，并用清除有机自由基1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）法评价其抗氧化活性[17]，以明确藏茶茶褐素的基本化学组成及其清除自由基的能力，以期为探究藏茶抗氧化功能的物质基础、作用机制及应用潜力提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藏茶（康砖）购自四川吉祥茶业有限公司。

氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、浓硫酸、蒽酮、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、磷酸、氢氧化钠、氯化钡、乙酸钙、浓盐酸等，均为国产分析纯；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基（日本和光纯药工业株式会社）；Amicon-Ultra-15（5、10、50、100 kDa MWCO）超滤管（美国Millipore公司）。

1.2 主要仪器

精密电子天平（德国Sartorius 公司）；R-200 型旋转蒸发仪（瑞士Büchi 公司）；Gamma 1-2 真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；Ultrospec6300 pro多功能紫外/可见光分光光度计（美国通用电气公司）；FTIR-8400S傅里叶变换红外光谱仪（日本Shimadzu 公司）；QUANTA-450 环境扫描电子显微镜（美国FEI 公司）；国产超声水浴恒温箱、循环水式多用真空泵、真空干燥箱和Delta 320 pH计。

1.3 实验方法

1.3.1 茶褐素的提取与分离制备

以康砖茶为原料，利用茶褐素溶于水，不溶于氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂的特性[18]，依次洗脱茶褐素水提物中的咖啡碱、茶黄素、茶红素和皂苷后，利用超滤膜分离技术对茶褐素进行逐级分离制备，具体工艺流程见图1。

1.3.2 茶褐素的理化性质分析

紫外-可见光谱扫描：将不同分子质量范围的茶褐素按比例配成质量浓度为18.4 μg/mL 的水溶液，在190～700 nm波长范围内进行扫描，扫描次数30次，最小波长0.5 nm。

图1 藏茶茶褐素的提取分离流程图Fig.1 Extraction and separation flow diagram of theabrownines from Tibetan tea

红外光谱扫描：将样品与溴化钾按适当比例混合研磨后压片，以溴化钾为背景，用FTIR-8400S 傅里叶变换红外光谱仪进行扫描，扫描次数32 次，扫描范围400～4 000 cm－1，分辨率8 cm－1。

蛋白质的检测：采用考马斯亮蓝G-250 法，根据要求制作标准曲线，设置样品管和参比管。样品管加1 mL待测液，5 mL考马斯亮蓝试剂；参比管加1 mL 蒸馏水，5 mL 考马斯亮蓝试剂。在595 nm 波长下测定。

茶多糖的测定：采用蒽酮-硫酸法，参照文献[19]作适当改进。标准曲线的绘制：配制一定浓度的葡萄糖溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于试管中，均用蒸馏水补足至1.0 mL，分别加入4 mL蒽酮-硫酸试剂，混匀后立即置于冰水中，待所有样品加完后一起于沸水中加热7 min，然后在冰水中冷却30 min，于620 nm波长处比色。由于茶褐素本身具有颜色，为了降低茶褐素颜色对多糖测定的影响，每个样品设一个对照，由1 mL 一定质量浓度的茶褐素、1 mL用来代替显色剂的蒸馏水及5 mL 浓硫酸组成，将其混匀后，分别吸取相同质量浓度的茶褐素1 mL于试管中，其余操作同标准曲线的绘制。以样品的吸光度值减去对照的吸光度值，并通过标准曲线算得茶多糖的含量。

官能团的定量分析：参照秦谊等[20]的BaCl2和Ca(CH3COO)2沉淀法对茶褐素官能团进行定量分析。1）酸性基的测定：取样0.02 g，加20 mL 0.1 mol/L NaOH，用0.75 mol/L BaCl2定容至50 mL，振摇30 min后过滤，滤液用0.1 mol/L HCl 标准溶液作电位滴定，以pH 8.4 为滴定终点，并做空白对照。2）羧基的测定：取样0.05 g，加10 mL 0.1 mol/L NaOH，再加与NaOH等当量的HCl标准溶液，用1 mol/L乙酸钙定容至50 mL，振摇20 min后过滤，滤液用0.1 mol/L NaOH标准溶液作电位滴定，以pH 8.4为滴定终点，并做空白对照。

1.3.3 茶褐素的微观结构分析

将导电双面胶带贴于铝载物台上，在双面胶上涂抹茶褐素样品，多余的样品用洗耳球吹去，将载物台放于扫描电子显微镜下进行观察，低真空压力为稳定的70 Pa，电子枪加速电压为20 kV。

1.3.4 茶褐素清除DPPH 自由基能力的测定

取茶褐素样品，用蒸馏水配制成不同质量浓度的样品液。分别取2 mL 样品液于试管中，加入2×10－4mol/L DPPH 自由基溶液（用无水乙醇配制）2 mL，混合均匀，避光反应30 min 后在517 nm 波长处测定其吸光度值（D1）；以2 mL水代替茶褐素样品，测定其吸光度值（D0）；为消除样品本身的影响，以2 mL 样品与2 mL 无水乙醇混合，测定其吸光度值（D2）；以2 mL水与2 mL无水乙醇的混合液调零[17]。

DPPH自由基清除率/%=[1－(D1－D2)/D0]×100.

1.3.5 数据分析

使用Excel 2010、Origin 7.5和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，使用邓肯法进行显著性检验。

2 结果

2.1 不同分子质量范围茶褐素组分的得率

按照图1 所示的制备流程，采用膜分离技术对藏茶茶褐素提取物进行逐级分离，结果如表1所示：从藏茶茶褐素提取物中，未分离出分子质量小于5 kDa的色素物质；得到的4个不同分子质量范围的茶褐素组分中，TBFs1、TBFs2、TBFs3 的得率相近，所占比例分别为17.70%、13.55%、18.76%，而占比最高的是TBFs4 组分（49.99%）。说明藏茶茶褐素的组成以分子质量大于100 kDa的物质居多。

表1 不同分子质量范围茶褐素的得率Table 1 Yield of theabrownines with different molecular mass distribution

2.2 藏茶茶褐素各组分的光谱学分析

2.2.1 紫外-可见光谱分析

将相同质量浓度的茶褐素各组分在190～700 nm波长范围内进行扫描，各样品在可见光区无明显吸收峰，在500 nm附近吸光度值已趋近于0，各组分的紫外-可见光谱经等比例重叠后如图2所示。藏茶茶褐素各组分的谱图具有相似性，均在202 nm附近有最大吸收峰，在269 nm附近有较弱肩峰。而相同质量浓度的各茶褐素组分在波峰处的吸光度值存在差异，其吸光度强弱表现为：TBFs4＞TBFs2＞TBFs3＞TBFs1，说明不同分子质量范围茶褐素的化学组成有所不同。此外，图2 中的2 处吸收峰刚好位于苯的紫外吸收光谱的E2 带（204 nm）和B 带（230～270 nm）处，其相应的吸收强度也与苯环相似。因此，推测藏茶茶褐素在此处的吸收峰是由其中的芳香环结构引起的，该结构是茶褐素酚类聚合物的基本组成部分。而不同茶褐素组分由于芳香环结构或取代基的差异，其最大吸收波长会有不同程度的移动。

图2 不同分子质量范围茶褐素的紫外-可见光谱图Fig.2 Ultraviolet-visible spectrogram of theabrownines with different molecular mass distribution

2.2.2 红外光谱分析

从图3 可看出，藏茶茶褐素各组分的化合物组成较复杂，红外吸收峰重叠较严重，无论是官能团区（4 000～1 300 cm－1）还是指纹区（1 300～600 cm－1），不同分子质量范围茶褐素的谱峰形态无明显差异，可识别的峰型基本一致。如图3所示：3 334 cm－1附近的强宽吸收峰为羟基O—H 或氨基N—H 的伸缩振动峰，峰宽显示存在分子内和分子间氢键，是判断酚类物质或蛋白质存在的依据；2 933 cm－1附近为烷基C—H 的反、对称伸缩振动峰；1 618 cm－1附近为C=C 骨架伸缩振动或氨基N—H 变角振动引起的强吸收峰；1 402 cm－1附近为O—H面内弯曲振动峰；1 053 cm－1附近为C—O—C的伸缩振动峰，可能是由苯并吡喃环结构引起的吸收；615 cm－1附近可能为卤代烃的伸缩振动峰。综上所述，藏茶茶褐素为含有苯环、烷基的多羟基酚类物质，可能还含有糖蛋白缀合物，与普洱茶[21]、茯砖茶[22]茶褐素的红外光谱分析结果存在相似性，说明黑茶茶褐素的官能团组成具有相似性，而其具体基团情况尚需借助其他相关手段做进一步分析。

图3 不同分子质量范围茶褐素的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrogram of theabrownines with different molecular mass distribution

2.3 藏茶茶褐素各组分的化学性质及成分分析

由表2可知：藏茶茶褐素各组分均呈酸性，随着分子质量逐级增大，各组分的pH 变化不大，仅TBFs2 与TBFs4 的pH 存在差异。酸性官能团定量结果显示：总酸性基和羧基的含量随着茶褐素分子质量的增大而呈现一定的增加趋势，尤其以TBFs4的增幅最显著；而酚羟基含量的变化并未呈现类似的趋势，但含量最高的仍是分子质量最大的TBFs4。此外，茶褐素各组分的酚羟基含量均为羧基含量的2 倍以上，且酚羟基在不同组分的含量差异最为显著，说明酚羟基是藏茶茶褐素中的主要酸性官能团。

鉴于光谱学分析认为藏茶茶褐素提取物可能含有蛋白质和多糖等络合物，我们对蛋白质和多糖的相对含量进行了测定，结果如表2 所示。随着茶褐素分子质量的逐级增大，蛋白质的相对含量总体呈增加趋势；而多糖含量的变化并无此规律，其相对含量最高和最低的组分分别为TBFs1 和TBFs2。暗示蛋白质、多糖对茶褐素的结合方式不同，且蛋白质对茶褐素的结合可能与酸性基团有关。

表2 不同分子质量范围茶褐素的pH及各成分测定结果Table 2 Determination result on pH and compositions of theabrownines with different molecular mass distribution

2.4 藏茶茶褐素各组分的扫描电镜分析

用扫描电镜观察茶褐素各组分聚集体的表面形貌特征，结果如图4 所示。TBFs1（5～10 kDa）聚集体呈不规则块状结构，在1 600×视野下可见其表面较光滑但不规整，有凹陷和乳突状大颗粒分布。暗示TBFs1各分子间交联紧密，相互作用力较大，易形成紧密结构，可能与该组分的多糖含量高有关。TBFs2（＞10～50 kDa）样品呈片状或碎屑状堆积，碎片表面较平整，随着放大倍数的增加（1 600×），可见其表面呈现紧密的“蜂窝状”结构，暗示TBFs2分子质量较大，具有长链或多分枝结构，分子间易交叉粘连，相互间的作用较强。TBFs3（＞50～100 kDa）的聚集体呈折叠和卷曲形状，在1 600倍镜下，可见其表面形貌较为规则且呈丝网状结构，说明分子间结合紧密，相互作用较强。而TBFs4（＞100 kDa）样品则堆积成各种无规则的形貌结构，有枝叶状、屑状、片状、杆柱状和颗粒状等，暗示该部分组分的分子特征形态多样化，促使各类大分子物质无规则聚集。综合以上观察结果，可见藏茶茶褐素各组分的天然形貌和聚集形态存在明显差异，这与各自的分子质量大小、分子间力、大分子的组成及微观结构等有关。

图4 不同分子质量范围茶褐素的扫描电镜图Fig.4 Scanning electron microscopy of theabrownines with different molecular mass distribution

2.5 藏茶茶褐素各组分清除DPPH 自由基的活性评价

DPPH自由基在国内外被广泛用于清除自由基物质性质的研究与天然抗氧化剂的筛选。若受试物能将其清除，则表明该受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基的有效浓度和阻断脂质过氧化链的作用[17]。由图5可见：4种不同分子质量范围的藏茶茶褐素均有清除DPPH自由基的能力，但其清除率都低于对照（维生素C）。总体而言，在所示质量浓度区间（10～80 μg/mL），随着反应体系中茶褐素质量浓度的增加，其对DPPH 自由基的清除率逐渐上升，呈现明显的剂量关系。

为进一步探明藏茶茶褐素各组分清除DPPH自由基活性的差异，我们计算了不同茶褐素组分的DPPH 自由基半抑制浓度（median inhibition concentration,IC50），结果如表3所示。不同组分间的IC50值差异均达到显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）水平，说明不同分子质量范围的4 类茶褐素清除DPPH自由基的活性差异显著，其清除能力由高到低依次为TBFs4（＞100 kDa）、TBFs2（＞10～50 kDa）、TBFs3（＞50～100 kDa）、TBFs1（5～10 kDa）。这也说明，尽管藏茶茶褐素各组分清除DPPH 自由基的活性有差异，但该活性的高低与分子质量大小并无直接联系。

图5 不同质量浓度茶褐素组分清除DPPH自由基的能力Fig.5 DPPH radical scavenging ability of theabrownine fractions with different concentrations

表3 不同茶褐素组分的DPPH自由基半抑制浓度（IC50）Table 3 Median inhibition concentration (IC50) of different theabrownine fractions on scavenging DPPH radicals

3 讨论

3.1 藏茶茶褐素的组成及特征

本文借助膜分离技术对藏茶茶褐素进行分离，得到4 个不同分子质量范围的茶褐素组分TBFs1（5～10 kDa）、TBFs2（＞10～50 kDa）、TBFs3（＞50～100 kDa）和TBFs4（＞100 kDa）。值得注意的是，藏茶茶褐素中并未分离到分子质量小于5 kDa的色素物质，这与普洱茶[21]、青砖茶[23]等黑茶茶褐素的分子质量范围存在差异，也印证了王伟伟等[6]的观点，认为不同黑茶种类提取的茶褐素在分子质量上有较大差异。结合黑茶加工工艺和原料来看，多次高温渥堆发酵和加湿加温反复揉捻（馏）是藏茶生产较显著的特点[1]；相比青砖茶和茯砖茶，藏茶渥堆时间更长，在此环节的物质转化程度更深；而藏茶与普洱茶最大的区别在原料，前者多为中小叶种，后者则为大叶种，其内含物质基础已决定了两者的差异。这些特点和差异都有可能影响茶褐素分子质量大小及组成，它们之间的具体关系有待进一步研究。

在藏茶茶褐素的化学组成方面，随着茶褐素分子质量的逐级增大，总酸性基、羧基、蛋白质相对含量也呈相应的增加趋势，这一变化规律符合黑茶加工中内含成分转化及茶褐素形成的特征，即多酚类物质通过氧化聚合反应形成大分子物质，并逐渐伴随有蛋白质、糖类、有机酸等通过氧化、聚合、耦合作用与这些酚类大分子物质共同形成茶褐素[4,7]。杨大鹏等[11]研究发现，黑茶渥堆过程中，茶褐素提取物中的蛋白质和多糖含量随渥堆时间和翻堆次数的增加总体呈上升趋势。本研究中，蛋白质含量最高的是分子质量最大（＞100 kDa）的茶褐素组分TBFs4，而多糖含量最高的则是分子质量范围最小（5～10 kDa）的茶褐素组分TBFs1。暗示在黑茶渥堆后期不单是茶红素等大分子高聚物在参与茶褐素形成，也存在氧化聚合度相对较低的酚类物质与多糖结合形成茶褐素，这可能也是黑茶渥堆过程中茶褐素增加量大于茶红素和茶黄素减少量的原因之一[3,7]。

3.2 藏茶茶褐素清除DPPH 自由基的活性及物质基础

人体内的疾病发生与自由基的存在有着密切联系，这也使得抗氧化剂的研究与开发成为当今的热点[24-25]。与合成抗氧化剂相比，天然抗氧化剂在食品安全性方面更具优势[26]。茶叶中活性成分的抗氧化机制主要为：阻断自由基链式反应，作用于自由基或与自由基有关的酶，清除活性氧使单线态的氧淬灭，螯合金属离子使其失去活性，以及协同抗氧化等。本研究发现，藏茶茶褐素是可以直接作用于DPPH自由基的活性物质。

在活性成分方面，有研究认为多糖具有显著的自由基清除活性[27]，而本文中多糖含量最高的TBFs1（5～10 kDa）组分对DPPH自由基的清除率却最低，说明藏茶茶褐素清除DPPH 自由基的活性与其多糖含量并无直接联系。孙娅[28]在对低活性多糖的研究中也发现，茶多糖清除自由基的能力与多糖提取率、各组分含量并无明显的量效关系，而多糖特有的结构特征对其活性影响更大。另有研究表明，分子质量大小是多糖具备生物活性的必要条件[29]，这可能与其保证高级结构的构象有关。这些都有助于我们认识茶褐素中多糖与其清除自由基之间的关系。

通过比较表2和表3的数据发现，茶褐素各组分的酚羟基含量与清除DPPH自由基活性的变化趋势最为一致，均为TBFs4＞TBFs2＞TBFs3＞TBFs1。此外，光谱学分析得出的茶褐素主要基团也是以多羟基酚类物质为主。因此，我们推测藏茶茶褐素清除DPPH自由基的物质基础可能以酚性基团或酚类物质为主，这与茶红素中的抗氧化活性结构（酚羟基、苯骈卓酚酮结构）存在相似之处[25]。说明藏茶茶褐素可能具有与其主要前体物质（儿茶素、茶红素、茶黄素）相似的抗氧化作用途径，可进一步用于天然抗氧化剂的筛选及抗氧化机制研究。

4 结论

藏茶茶褐素中未分离出能透过5 kDa超滤膜的色素物质，分子质量大于100 kDa 的茶褐素组分占49.99%，与其他黑茶茶褐素的分子质量分布存在差异。藏茶茶褐素在202 nm附近有紫外特征吸收峰，为含有烷基、苯环和羧基的多羟基酚类物质，同时还结合有蛋白质和多糖。蛋白质在分子质量大于100 kDa 的茶褐素组分中结合比例最高，而多糖则更偏向与分子质量相对较低的茶褐素组分结合。

藏茶茶褐素具有清除DPPH 自由基的活性，在10～80 μg/mL范围内其质量浓度与DPPH自由基的清除率呈线性正相关，其活性物质基础可能以酚性基团或酚类物质为主。尽管藏茶茶褐素在既定质量浓度范围内DPPH自由基清除率不及药用抗氧化剂维生素C，但这不影响其用于天然抗氧化剂的筛选及抗氧化机制的研究。后续研究可借助细胞自噬模型、线虫模型、体外化学分析手段等对藏茶茶褐素的抗氧化及抗衰老等活性进行评估；同时，还需结合现代分离纯化技术、现代谱学分析技术、蛋白质组学以及代谢组学等，来研究藏茶茶褐素的化学成分及活性物质的结构特点，并探索其活性作用的关键靶点和主要通路。