一例鸭传染性浆膜炎病原的分离与鉴定

贾仰波

(山东省博兴县畜牧兽医局山东滨州 256500)

鸭传染性浆膜炎也被称为鸭疫里默氏杆菌病，是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染家鸭、野鸭而引起的一种急性、败血性传染病，该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等为主要病理特征，感染鸭多出现食欲废绝、精神不振、站立不稳等神经症状，严重阻碍病鸭的生长。鸭疫里默氏杆菌主要感染1～8 周龄雏鸭，其中尤以10～30 日龄的雏鸭最为易感，近年来随着我国鸭饲养量的不断增加，鸭传染性浆膜炎发病率和死亡率均呈现逐步上升的趋势，有研究发现一旦感染鸭群发病率可高达70%，死亡率可高达80%，因此鸭传染性浆膜炎是危害当前养鸭业的主要细菌性传染病之一。

1 发病情况

2018 年10 月-2019 年2 月，山东滨州某规模养鸭场饲养的雏鸭在28 日龄左右持续发病。大多数病鸭表现精神不振、采食量降低、头颈震颤、排白绿色稀便、站立不稳等临床症状，每天死亡40只左右。

2 病理剖检

随机取50 只病死鸭进行剖检，发现大多数病死鸭大脑水肿出血、脑膜增厚，部分病死鸭出现纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎等，其他脏器没有明显的病变。根据临床症状及病理剖检初步怀疑为鸭传染性浆膜炎，为进一步确定病原菌，无菌条件下采集疑似鸭传染性浆膜炎病死鸭的肝脏、心脏、脑等组织器官进行病原菌分离。

3 病原分离及形态观察

无菌条件下将分离的组织病料分别接种到含2%新生牛血清的TSA 培养基和麦康凯培养基上，TSA 培养基置于37℃恒温5%CO2培养箱中静置培养24 h，麦康凯培养基置于37℃恒温培养箱中静置培养24 h，观察菌落生长情况及形态。结果肝脏、心脏、脑等组织在含2%新生牛血清的TSA 培养基上均出现了圆形、边缘整齐、透明的菌落，麦康凯培养基上均无菌落，将分离培养的细菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下用油镜观察分离菌的染色特性及形态，结果均为无芽孢、两极浓染的革兰氏阴性小杆菌，主要以单个杆菌形式存在，偶有长丝状。

4 生化试验

将分离菌分别接种于微量生化发酵管，具体操作参考生化反应管说明书，结果分离菌不发酵乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖，明胶试验结果为阳性，甲基红试验、VP 试验、硫化氢产生试验、硝酸盐还原和枸橼酸盐试验均为阴性。

5 PCR 鉴定

用已有的根据RA 16S rRNA 设计的通用引物进行PCR 扩增。引物 序列 如 下，P1：5'-TTA CCGAC TGAAAATTGCCTT-3'，P2:5'-AGAGGAAGACCGAGGACATC-3'，扩增片段为338bp；取纯化的分离菌液5mL，5,000rpm 离心5min，弃去上清，再用100μL 无菌的ddH2O 悬浮沉淀后，沸水中水浴10min，5,000rpm离心5min，取上清液作为PCR 模板；PCR 体系为：PCR mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，补灭菌水至20μL，同时设立阴阳性对照，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共30 个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后用1%的琼脂糖凝胶板电泳，电泳结束后，取出凝胶板用凝胶成像仪进行成像分析，结果与预期相符，由此可以确定该场雏鸭感染了鸭疫里默氏杆菌。

6 血清型鉴定

挑选单个菌落接种于含2%新生牛血清的TSA 培养基上，置于37℃恒温厌氧罐中静置培养24 h 后，用8mlTSB 培养基洗下菌液，然后与保存的鸭疫I 型、II 型、10 型、11 型阳性血清进行平板凝集，结果与鸭疫II 型血清出现明显凝集，由此判定该分离株为II 型鸭疫里默氏杆菌。

7 药敏试验

将分离菌均匀涂布在含2%牛血清的TSA 上，进行常规药物的药敏试验，将强力霉素、大观霉素、阿莫西林、新霉素、链霉素、林可霉素、红霉素、氟苯尼考、多粘菌素B、头孢唑肟、青霉素、氨苄西林共12 种药敏片贴在接种分离菌的平板上，37℃5%CO2微需氧条件下培养24—48h。结果发现该分离菌株对大观霉素、氟苯尼考高度敏感，对头孢唑肟中度敏感，其余9 种均耐药。

8 小结

近几年随着我国养鸭业的快速发展，鸭传染性浆膜炎发病率和死亡率均呈现上升的趋势，大大影响了养鸭业的经济效益。在鸭传染性浆膜炎临床诊断治疗过程中逐渐凸显出一些问题，结合此次研究总结以下几点：①常误诊断为鸭大肠杆菌病，因鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病在临床症状和病理剖检上极为相似，但两者的致病菌在培养特性、生化特性等方面差异较大，因此在实际诊断时应进行深入研究予以区别。本试验将疑似鸭传染性浆膜炎的分离菌，通过培养特性、形态观察、生化试验、PCR 鉴定、分型鉴定等研究，鉴定分离菌株为II 型鸭疫里默氏杆菌；②实际养殖过程中鸭传染性浆膜炎防控的关键措施还是疫苗免疫，但因鸭疫里默氏杆菌血清型众多，且不同血清型之间缺乏有效的交叉保护，所以常导致免疫失败的情况发生；③发病后主要依靠抗生素类药物进行治疗，由于用药不科学、不规范等众多原因，使得养殖业中抗生素的滥用现象极为严重，除造成药物残留外，还导致了大量耐药菌株的出现，当前鸭疫里默氏杆菌的耐药现象越来越严重，且多重耐药情况也越来越普遍。因此，本研究在确定病原菌的同时，通过药敏试验对该分离株敏感药物进行了筛选，确定大观霉素、氟苯尼考应作为该养鸭场防治的首选药物，其他药物可暂停使用，同时对整个鸭群开展针对II 型鸭疫里默氏杆菌的疫苗强化免疫，采取措施后，疫情得到有效控制，逐渐好转；④由于养殖环境、管理模式等因素的不同，不同养殖场鸭传染性浆膜炎发病率和死亡率有所差异，发病情况也有所不同，常发生鸭传染性浆膜炎与其他疾病联或多种血清型混合感染的情况，因此养殖过程中必须做好有效免疫、科学用药等基础功课，才能有针对性的预防疫病的发生。