不同体况对妊娠初期母牛阴道菌群的影响

刘 波 斯木吉德 王纯洁 阿日查 张 剑 陈 浩 何利娜 张 晨 崔银雪 敖日格乐*

(1.内蒙古农业大学 动物科学学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学 兽医学院，呼和浩特 010018)

肉牛的体况评分是评价一头肉牛个体能量存储情况以及肉牛能量平衡程度的重要方法，是目前广泛应用的评估肉牛体能储备是否平衡的实用方法，是肉牛饲养管理中不可缺少的工具[1]。体况对母牛的繁殖机能会产生重要影响，在整个繁殖周期中维持肉牛适宜的体况，既能保持其良好的繁殖性能，又能降低饲养成本，取得较好的经济效益[2]。周贵等[3]研究表明，为取得理想的繁殖性能，繁殖母牛的体况应保持在2.5～3分(5分制)或5～6分(9分制)的范围内。

妊娠初期在整个妊娠期内有重要作用，有研究表明妊娠初期阴道菌群发生紊乱会显著增加早产和流产风险，妊娠初期的阴道菌群状态可以预测妊娠结局[4-5]。姜宏星等[6]研究表明奶牛产前产后的体况直接影响本胎次乃至终生的繁殖水平，体况过肥或偏瘦均会造成奶牛繁殖力下降。周颖等[7]研究表明母猪在妊娠期保持中等体况繁殖性能较好。李元刚等[8]研究发现在妊娠初期保持母貂中等体况有助于发挥其繁殖性能。因此在妊娠初期保持良好的体况是很重要的。牛的阴道中存在大量种类繁多的微生物及多种常驻菌。正常情况下，这些常驻菌群与宿主、环境之间相互协调、相互作用、相互制约，共同维持阴道的平衡状态[9]。这种平衡状态与牛的生殖健康紧密相关，一旦遭到破坏，如外界环境、自身激素水平和免疫力的改变，就会引发一些繁殖障碍疾病[10]。刘畅[9]研究发现健康、体况良好的肉牛阴道细菌有气球菌、绿色气球菌、睡眠嗜血杆菌、多动物链球菌、嗜冷杆菌、大肠杆菌和鞘氨醇单胞菌，黄体期和卵泡期阴道菌群结构有差异。Mateus等[16]研究指出，与未妊娠的奶牛相比，妊娠期的奶牛往往表现出较低的阴道菌群Alpha多样性。Gunay等[11]研究发现狗卵泡期阴道细菌数量显著高于黄体期。

然而到目前为止，关于牛微生物区系的研究主要集中在胃肠道，而对于不同体况放牧肉用繁殖母牛妊娠初期阴道菌群结构的研究尚未见报道。对于肉牛养殖来说，保持繁殖母牛拥有较好的繁殖力，对扩大种群以及提高养殖效益具有重要意义。而拥有较好繁殖能力的前提是母牛在妊娠期间保持良好的体况，如果过肥或者偏瘦则会引起难产、出生犊牛体质瘦弱、成活率低等问题，同时良好的阴道菌群结构可以降低繁殖障碍疾病的发生率。因此本研究在妊娠初期通过对不同体况肉牛阴道菌群结构的研究，了解繁殖母牛阴道菌群组成以及是否有致病菌异常增加，对发展肉牛健康养殖、降低繁殖障碍疾病发病率和提高繁殖力具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在内蒙古自治区锡林郭勒盟乌拉盖草原选择相同放牧条件下2～3 胎身体健康的妊娠初期西门塔尔母牛18 头。采用9分制评分标准[12]将其分为3组，每组6 头分别为FC(肥胖组),7～8分、MC(标准组)，5～6分、TC(偏瘦组)，3～4分。

1.2 样品采集

在样品采集之前，先用清水将牛外阴部清洗干净，然后用25%碘溶液对外阴部进行消毒，避免粪便污染。使用本实验室自制取样器采集样品。将棉拭子置于阴道2/3处1 min，使棉拭子与阴道分泌物充分接触，将棉拭子取出后放在1.5 ml离心管中，迅速放于液氮中并送回实验室，以便细菌DNA提取。

1.3 指标测定及数据分析

将粘有阴道分泌物的棉签置于离心管中放置于干冰上送往北京诺和生物信息科技有限公司。对341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)的16S rRNA V3～V4区域进行扩增测序。详细步骤见参考文献[13]。利用Barcode区分样本序列，在对各组样本序列进行过滤。利用Uparse软件(Uparse V7.0.1001)对所有有效数据进行OTUs聚类和物种分析，所有聚类均在默认为97%的相似度下进行。使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线、Rank abundance曲线，使用Qiime软件(Version 1.9.1)进行Alpha多样性及菌群结构分析，Alpha 多样性指数包括丰富度指数(Chao1 指数、ACE指数)、多样性指数(Simpson指数、Shannon 指数)和覆盖率(Good’s coverage 指数)。利用Beta多样性分析评价样品在物种复杂性方面的差异，对OTU数据进行主坐标分析(Principle coordination analysis，PCoA), 使用层次聚类方法非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)构建系统发育树，对距离矩阵进行解释，结合细菌群落柱状图，研究不同组间或样品间的菌群相似性和分类学差异性[14]。

数据采用Excel 2016整理，采用SPSS 20.0软件进行方差分析，并以P<0.05进行显著性检验，结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 测序结果及α多样性分析

通过Illumina HiSeq 测序平台测序对阴道细菌16S rRNA基因V3-V4高变区进行测序分析，18 份样品平均每个样品测得70 567条有效序列，经过质控平均得到 68 309 条序列，质控有效率达96.84%。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，共得到2 677 个OTUs，对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。注释结果中，共有37.58%的OTU注释到门水平；32.84%的OTU注释到科水平；24.36%的OTU注释到属水平。

通过绘制稀疏曲线来评判测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性(图1)，随着测序深度的增加，在测序量达到32 000时，曲线趋向平坦，说明取样的数量合理，测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，且能够很好地反映出所有样品的细菌群落结构和多样性。

表1显示了不同体况阴道菌群Alpha多样性指数，直接反映微生物群落的丰度及多样性。Shannon值越大，生物多样性越高；Simpson值越低，表明生物多样性越高；Chao1指数和ACE指数是估计物种总数的常用指数，值越大，生物多样性越高。Good’s coverage表示样本的测序深度。标准组阴道分泌物微生物群落的Alpha多样性指数的Shannon指数、Chao1指数和ACE指数均显著低于肥胖组和偏瘦组(P<0.05)，Simpson指数差异不显著(P>0.05)，表明标准组体况较好，机体内分泌正常、阴道内环境趋于稳定，物种多样性处于较低水平。各组阴道菌群的Good’s coverage指数均在99.4%以上，显示样本测序质量较高，未被检测到的可能性极低，足以检测阴道分泌物样本中的微生物群落信息。

不同颜色代表不同样品Different samples were represented by different colors图1 18份样品的稀释曲线Fig.1 Dilution curve of 18 samples

表1 不同体况妊娠初期母牛阴道菌群α多样性指数Table 1 Alpha diversity index of vaginal flora of cows in early pregnancy with different body conditions

2.2 β多样性分析

β多样性分析是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。主坐标分析反映了各样本中菌群构成的相似性。基于Weighted Unifrac距离进行PCoA分析(图2)，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。如果样本距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起，群落差异较大的样本则会远远分开。由图2可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为总变量的58.86%和18.89%，肥胖组(FC)、标准组(MC)、偏瘦组(TC)几乎聚在一起，差异不显著(P>0.05)。

横纵坐标分别为第一和第二主成分，百分比表示主成分对样品差异的解释率；图中的每个点表示一个样品，同一组的样品用同一种颜色表示The abscissa and ordinate were the first and second principal components respectively, and the percentage represents the interpretation rate of the principal component to the sample difference; each point in the diagram represents a sample, and the samples of the same group were shown in the same color图2 各组样品基于Weighted Unifrac距离PCoA分析Fig.2 Weighted Unifrac distance PCoA analysis for each group of samples

2.3 阴道菌群构成及丰度分布

2.3.1门水平阴道菌群分布丰度

由表2可知，不同体况妊娠初期繁殖母牛阴道分泌物中10大优势菌门分别是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、无壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、未知菌(Unidentified_Bacteria)、螺旋体菌门(Spirochaetes)和Melainabacteria。厚壁菌门在肥胖组、标准组、偏瘦组的丰度分别为54.16%、56.38%和57.03%，拟杆菌门在3组的丰度分别为24.56%、30.04%和22.37%，变形菌门在3组的丰度分别为3.86%、3.14%和5.83%。而在非优势菌门中，无壁菌门在肥胖组、标准组、偏瘦组的丰度分别为1.34%、2.06%和1.72%；放线菌门在3组的丰度分别为1.63%、1.67%和1.79%；梭杆菌门在3组的丰度分别为1.80%、1.25%和1.23%；疣微菌门在3组的丰度分别为0.58%、0.35%和0.70%；未知菌在3组的丰度分别为0.50%、0.36%和0.89%；螺旋体菌门在3组的丰度分别为0.31%、0.25%和0.22%； Melainabacteria在3组的丰度分别为0.26%、0.15%和0.20%。结果表明，阴道菌群随着体况不同而发生变化，偏瘦组变形菌门分布丰度高于标准组和肥胖组，拟杆菌门的分布丰度标准组高于肥胖组和偏瘦组，但差异不显著(P>0.05)；其他菌门分布丰度无明显变化，差异不显著(P>0.05)。

表2 门水平上阴道菌群丰度Table 2 Abundance of vaginal microbiota at phylum level %

2.3.2属水平阴道菌群分布丰度

在属水平上，由于属的种类多且部分属的相对丰度较低，因此仅对排名前10的属进行分析。由表3 可知，不同体况妊娠初期繁殖母牛阴道分泌物中10大优势菌属分别是拟杆菌属(Bacteroides)、阿利斯佩斯菌属(Alistipes)、气球菌属(Aerococcus)、费氏菌属(Faecalibacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、嗜组织菌属(Histophilus)、脲原体菌属(Ureaplasma)和支原体属(Mycoplasma)。拟杆菌属在肥胖组、标准组、偏瘦组的丰度分别为3.79%、4.26%和3.38%；阿利斯佩斯菌属在3组的丰度分别为2.78%、2.71%和2.15%；气球菌属在3组的丰度分别为1.15%、0.85%和1.12%；费氏菌属在3组的丰度分别为0.73%、0.73%和0.33%；链杆菌属在3组的丰度分别为0.63%、0.80%和1.13%；链球菌属在3组的丰度分别为0.58%、0.17%和0.48%；棒杆菌属在3组的丰度分别为0.51%、0.48%和0.29%；嗜组织菌属在3组的丰度分别为0.03%、0.99%和0.27%；脲原体属在3组的丰度分别为0.17%、0.20%和0.14%；支原体属在3组的丰度分别为0.04%、0.09%和0.01%。结果表明，随着体况的不同，标准组嗜组织菌属分布丰度显著高于其他2组(P<0.05)、拟杆菌属分布丰度高于其他2组，气球菌属分布丰度低于其他2组，偏瘦组链杆菌属分布丰度高于其他2组，但差异均不显著(P>0.05)。

表3 属水平上阴道菌群丰度Table 3 Abundance of vaginal microbiota at genus level %

3 讨 论

本研究利用16S rRNA高通量测序技术，对不同体况妊娠初期繁殖母牛的阴道菌群的丰度和多样性进行了比较。结果表明，体况的不同对母牛阴道微生物区系结构有一定影响，菌群丰度各不相同。通过Alpha多样性指数分析，标准组母牛阴道菌群多样性低于肥胖组和偏瘦组。从PCoA分析结果来看，标准组和肥胖组菌群相似性较高，但和偏瘦组差异不大。Wang等[15]研究表明，患有子宫内膜炎奶牛阴道Alpha多样性指数显著高于健康奶牛，这与子宫内膜炎的发生过程一致，即由优势菌支配的微生物群落结构被破坏，病原菌数量增加，子宫内膜炎发病的一个重要因素是阴道内的细菌扩增进入子宫。而标准组体况母牛机体状况良好，机体为妊娠提供了较好的环境保障，阴道内环境相对其他两组较为稳定，因此菌群结构维持在较低水平。通过对门水平上菌群结构分析发现，标准组阴道主要菌门为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门。Laguardia-Nascimento等[16]研究指出不同品种妊娠和非妊娠牛阴道菌群主要由厚壁菌门(40%～50%)、拟杆菌门(15%～25%)、变形菌门(5%～25%)和未知菌门(10%～20%)组成。这与本研究基本吻合，拟杆菌门和无壁菌门有助于子宫内膜的恢复[17]。牛易受到各种病原体引起的与生殖道有关的疾病的影响，如类杆菌属、支原体、嗜组杆菌属、梭杆菌属、链球菌属等[18,19-20]。球菌属通常定植在哺乳动物的皮肤和粘膜上，也存在于口腔、肠道、泌尿生殖道和上呼吸道[21]。支原体属和脲原体属广泛定植于动物泌尿生殖道黏膜上，并不会引起任何症状，而当机体免疫力低下时会引发炎症[22]。Funke等[23]研究认为棒状杆菌是人类正常皮肤菌群的一部分。传统培养方法研究发现，健康牛阴道菌群主要由链球菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、乳杆菌属及少量真菌组成[24-25]。侯荣伦[26]研究健康奶牛生殖道菌群发现乳酸菌是主要优势菌，且不孕症奶牛生殖道内乳酸菌数量低于健康奶牛。在本试验中，虽然检测出乳酸杆菌属，但其含量在3个组中均属于偏低水平，未在图表中展示。这与刘畅[9]的研究结果一致，肉牛阴道中存在少量的乳酸杆菌属。标准组嗜组织菌丰度显著高于肥胖组和偏瘦组，其他菌属差异不大。虽然有研究表明该菌可能是引起奶牛子宫内膜炎的因素之一且病因不明确[27]，但本试验所选母牛均为未患繁殖障碍疾病牛，只在体况上进行区分，因此可能是其他因素导致该菌丰度增加，这也说明了阴道中存在少量致病菌并不足以致病，但可以使养殖者及时了解母牛阴道菌群中有害菌是否有升高的趋势。因为牛的外阴部位于肛门的正下方，经常会被排出的粪便所覆盖，而外阴部的开口可能会使粪便中的少量致病菌进入，有研究证明，许多生殖道疾病均是由粪便中微生物引起[28-29]。本试验中检测出的少量费氏杆菌属和阿利斯佩斯菌属也有可能是在样品采集之前已经通过粪便进入阴道[30-31]。由于本试验结果中肥胖组、标准组和偏瘦组阴道菌群的主要优势菌门和优势菌属组间差异并不显著，可能是因为本试验所选母牛均为体质健康并处于妊娠初期阶段，而体况对母牛在妊娠初期阶段阴道内环境稳态影响不大进而导致主要优势菌门和优势菌属丰度处于正常水平差异不显著，但在妊娠初期保持母牛阴道内环境稳定仍是十分重要的，可在之后的试验中对妊娠中后期不同体况母牛阴道菌群进行测定，进一步探索体况对阴道菌群的影响。

研究表明，阴道微生物群落通过生物屏障、产生乳酸、细菌素和过氧化氢等多种机制在维持生殖道健康方面起着至关重要的作用[32-33]。机体会受到多重因素的影响从而导致阴道菌群结构发生变化，这些因素包括基因、自身的防御屏障系统、年龄、品种、免疫功能、激素分泌等[7]。体况过肥或过瘦会影响血液离子、激素、营养物质代谢水平，降低机体免疫力和繁殖性能[34]，从而对妊娠初期母牛阴道微生物稳态产生影响。而阴道微生物菌群失调可能是引发阴道炎和生殖道感染的重要因素，从而损害生殖性能，造成重大的经济损失[35]。另外致病性细菌感染可引发子宫内膜炎最终导致胚胎早期死亡，严重阻碍繁殖母牛繁殖力。尽管抗生素已经被广泛应用于雌性动物繁殖疾病，但细菌耐药性和抗生素残留等问题正变得越来越突出[36]。Kavyashree等[37]研究发现对阴道菌群鉴定筛查可以有效调控奶牛生殖健康。因此，可通过对体况过肥和偏瘦的妊娠母牛分群管理，对于体况过肥的母牛可适当缩短其放牧采食时间，减少其能量摄入，逐步使体况恢复到标准体况范围，而对于体况偏瘦的母牛则延长其放牧时间或者收牧后进行适量补饲，进而增重到标准体况，进而使繁殖母牛在妊娠初期避免过肥或过瘦、保持良好的体况，同时明确微生物区系在生殖道健康中的作用和了解妊娠初期菌群结构对防治生殖道感染具有重要意义，可通过提早对不良体况繁殖母牛进行阴道微生物检查，尽早发现可能引起繁殖疾病的菌群变化，及早预防，降低繁殖障碍疾病发生的概率，减少损失。

4 结 论

利用基于微生物16S rRNA基因测序技术，探索了不同体况妊娠初期繁殖母牛阴道菌群变化情况。本研究发现，标准体况母牛阴道微生物多样性和丰度最低，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门分别为肥胖组、标准组和偏瘦组主要的优势菌门，拟杆菌属均为肥胖组、标准组和偏瘦组主要的优势菌属，不同体况母牛阴道微生物群落组成与结构均有变化并存在少量致病菌，但是差异不显著。本研究为使母牛在妊娠初期保持良好体况并有利于繁殖性能的发挥，同时为养殖者及时了解牛阴道菌群随体况变化提供了重要基础数据。