猪枪弹伤模型创伤失血休克后1 h内凝血功能变化分析

2020-11-26李开源王静孙荣距武惠韬张恒潘菲冯聪王俊康黎檀实

解放军医学杂志 2020年10期

李开源，王静，孙荣距，武惠韬，张恒，潘菲，冯聪，王俊康，黎檀实*

1解放军总医院第一医学中心急诊科，北京 100853；2解放军总医院医疗大数据应用技术国家工程实验室，北京 100853

全球每年因严重创伤死亡者约占总死亡人数的10%[1-3]。研究发现，约30%的创伤出血患者入院时存在凝血功能障碍，且在战场上发生枪弹伤或爆震伤时其比例更高[4-6]。急性创伤性凝血病(acute traumatic coagulopathy，ATC)是一种发生在创伤后早期，由组织损伤、大量出血和灌注不足导致的凝血系统不稳定的状态[7-9]，其发生机制包括内源性凝血系统激活、纤溶亢进或纤溶关闭等[10-11]，且在创伤后1 h内各种机制可能同时存在[12-14]。合并凝血功能障碍的伤员易发生静脉血栓栓塞、多器官衰竭(MOF)等并发症，从而导致病死率上升4倍[15]。本研究建立猪枪弹伤失血性休克模型，探讨创伤失血性休克后1 h内凝血系统的阶段性变化情况及相关因素，为ATC的临床个体化干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验场地成年健康长白猪20只，体重(50±5) kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地[动物许可证号：SCXK(京)2018-0011]。参与实验的兽医与负责运输的人员对实验设计不知情。保持实验动物正常昼夜节律，实验

前12 h禁食不禁水。实验场地为中国兵器工业第208研究所，参与实验的射手为该单位具有专业资质的人员，所用枪支由该单位提供。本研究动物实验方案符合动物伦理学标准(SC2019-06-013)。

1.2 猪枪弹伤失血性休克模型制备将舒泰50(法国Virbac公司，批号：76BP)与速眠新注射液(吉林华牧动物保健品有限公司，批号：180316)按2:1体积配比，以0.1 ml/kg肌注诱导麻醉；将舒泰50与速眠新注射液按1:1体积配比，溶于50 ml 0.9% NaCl溶液中，以10 ml/h的速度静脉注射维持麻醉，然后肌注美洛昔康注射液(保定阳光本草药业有限公司，批号：201906006)0.3 mg/kg。应用联合气管导管进行气管插管，无机械通气。将猪取仰卧位，在便携式超声诊断仪[飞依诺科技(苏州)有限公司，VINNO Q Series-7L]引导下行动静脉置管，置管成功后连接Picco监测仪[迈柯维(上海)医疗设备有限公司，PC8500]。

将猪腹部朝向射击方向，用麻绳将其双前肢、左后肢水平固定，右后肢垂直固定于试验台上，于射击前15min采集动、静脉血，并进行快速凝血、血栓弹力图、血气分析检测，记录3次，取平均值作为基础生理指标。使用便携式超声诊断仪定位右后肢股动脉走行并做体表射击标记线。射手取9 mm口径手枪，瞄准标记线射击，射击距离为2 m。射击完成后让猪自由出血，当平均动脉压(MAP)下降基础值的30%并持续10 s后，应用QuikClot止血纱布进行填塞止血，填满伤口后使用5块无菌医用纱布均匀用力持续按压3 min[16]，整个过程全部由同一人操作，待MAP稳定后，记录MAP数值为休克点血压值。实验全程未进行补液复苏或任何药物干预。

1.3 观察指标分析分别于射击前15 min、休克点、休克后10 min、休克后30 min、休克后1 h采集如下指标。

1.3.1 血流动力学指标使用Picco监测仪连续监测心率、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、MAP、全心舒张末期容积指数(global end-diastolic volume index，GEDI)、每搏量指数(stroke volume index，SVI)及体温。到达休克点后持续观察至1 h，1 h时未死亡动物给予麻醉过量安乐死。1 h内死亡动物记录死亡时间(死亡标准为呼吸停止或MAP为0并持续10 min)，并进行尸体解剖，动脉完全破裂者纳入本研究。

1.3.2 动脉血气分析指标使用动脉血气针抽取动脉血，并用血气分析仪(GEM3000)进行化验分析，分析指标包括pH值、氧分压(PO2)、K+浓度、Ca2+浓度、碱剩余(BE)、乳酸(LAC)值等。

1.3.3 常规凝血及血栓弹力图指标抽取静脉血，应用快速凝血指标检测仪(广州万孚生物技术股份有限公司，OCG-102)检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及纤维蛋白原(FIB)水平，应用血栓弹力图仪(陕西裕泽毅医疗科技有限公司，YZ5000)检测R值(反映凝血时间)、MA值(反映血栓强度)及LY30值(反映纤溶系统状态)。

1.3.4 出血量操作过程中使用的全部敷料及填塞纱布预先称重，射击前在试验台上铺设垫巾及纱布，利用大块纱布收集喷溅至周围的血液。实验过程中浸血后再次称重并计算与实验前的差值即为出血量。全程由同一人实时称重。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料采用单样本K-S法与正态Q-Q图进行正态分布检验，符合正态分布或近似正态分布的数据以表示；各指标随时间变化的整体效应比较采用重复测量资料的方差分析，不满足球形检验的数据采用Greenhouse-Geisser检验进行校正，其中两两时间点的比较采用LSD-t事后检验；凝血指标与血流动力学和血气指标的相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线分析结果共使用猪2 0 只，体重(55.69±2.75) kg，其中4只因尸体解剖发现动脉未断裂被排除，最终16只纳入本研究。其中雌性11只(68.75%)、雄性5只(31.25%)。经K-S检验，所有基线数据符合正态或近似正态分布。基线MAP为(133.9±21.6) mmHg，休克点MAP为(87.7±14.90) mmHg，MAP下降34%±4.6%，总出血量为(1444.22±205.50) ml，每千克体重出血量为(25.90±2.67) ml。其中5只在1 h内死亡，1 h生存率为68.75%，余11只收集到完整1 h数据，用于下述分析。经正态性检验，所有观察指标均符合或近似符合正态分布。

2.2 生命体征及血流动力学指标变化情况球形检验或Greenhouse-Geisser检验结果显示，心率、SBP、DBP、GEDI、MAP、SVI及体温随时间变化差异均有统计学意义(P＜0.05，表1)。LSD-t检验结果显示，与基础值相比，心率持续加快、体温持续升高，SBP、DBP、MAP、GEDI、SVI均下降，其中SBP、DBP、MAP从休克后30 min开始出现大幅度下降(P＜0.05)。

2.3 血气指标变化情况球形检验或Greenhouse-Geisser检验结果显示，pH值、PO2、K+浓度、Ca2+浓度、LAC水平、BE值随时间变化差异均有统计学意义(表2)。LSD-t检验结果显示，pH值、PO2、K+浓度在休克点升高(P＜0.05)，Ca2+浓度、BE值进行性下降，LAC水平进行性升高(P＜0.05)；其中pH值、PO2在休克后30 min开始大幅度下降(P＜0.05)，K+浓度在休克后30 min出现大幅度升高(P＜0.05)。

2.4 凝血指标变化情况球形检验或Greenhouse-Geisser检验结果显示，R值随时间变化差异有统计学意义(P＜0.01，表3)。LSD-t检验结果显示，PT、APTT、R值、FIB、MA值及LY30值均在休克后出现阶段性下降，具体表现为：PT、APTT及R值在伤后至休克后1 h内均有不同程度的下降(P＜0.05)；MA值在伤后至休克后10 min出现明显下降(P＜0.05)；LY30值在休克后10 min开始出现进行性下降(P=0.038)。

表1 长白猪生命体征及血流动力学指标随时间变化的整体效应检验(±s，n=11)Tab.1 Overall effect of vital signs and hemodynamic index over time in Landrace pigs (±s, n=11)

SBP. 收缩压；DBP. 舒张压；GEDI. 全心舒张末期容积指数；MAP. 平均动脉压；SVI. 每搏量指数

变量伤前15 min 休克点休克后15 min 休克后30 min 休克后1 h F P心率(次/min) 85.6±15.3 123.4±37.7 129.0±44.8 136.1±44.1 135.6±59.1 5.0 ＜0.001 SBP(mmHg) 170.5±15.6 111.6±15.8 98.6±21.9 97.8±17.6 68.4±31.8 32.3 ＜0.001 DBP(mmHg) 114.3±13.4 81.0±15.3 66.0±15.6 66.1±13.5 44.5±20.9 31.9 ＜0.001 GEDI(ml/m2) 1160.1±314.0 977.4±352.0 858.5±284.0 747.2±215.0 710.8±184.0 9.0 ＜0.001 MAP(mmHg) 139.5±16.1 93.8±12.0 80.3±18.3 79.1±10.8 55.1±23.1 44.7 ＜0.001 SVI(ml/m2) 53.7±14.4 36.2±17.2 30.5±16.0 23.0±11.1 23.6±14.6 11.0 ＜0.001体温(℃) 38.7±0.3 38.9±0.3 39.2±0.4 39.6±0.3 39.7±0.4 21.9 ＜0.001

表2 长白猪血气指标随时间变化的整体效应检验(±s，n=11)Tab.2 Overall effect of blood gas index over time in Landrace pigs (±s, n=11)

LAC. 乳酸；BE. 碱剩余

变量伤前15 min 休克点休克后15 min 休克后30 min 休克后1 h F P pH值 7.45±0.07 7.48±0.08 7.43±0.09 7.41±0.12 7.21±0.14 21.1 ＜0.001 PO2(mmHg) 63.9±14.6 74.5±21.0 73.0±16.4 72.7±20.0 53.3±22.9 6.9 ＜0.001 K+浓度(mmol/L) 3.93±0.27 4.95±0.98 4.74±0.89 4.88±1.60 6.42±2.11 7.3 ＜0.001 Ca2+浓度(mmol/L) 1.28±0.05 1.21±0.08 1.21±0.08 1.18±0.10 1.17±0.09 5.5 ＜0.001 LAC(mmol/L) 2.57±2.81 3.56±2.51 5.95±3.27 8.34±4.18 11.10±4.69 16.3 ＜0.001 BE(mmol/L) 7.06±4.31 4.41±4.64 0.88±6.05 -2.15±7.79 -6.88±7.80 32.0 ＜0.001

表3 长白猪凝血指标随时间变化的整体效应检验(±s，n=11)Tab.3 Overall effect of coagulation index over time in Landrace pigs (±s, n=11)

PT. 凝血酶原时间；APTT. 活化部分凝血活酶时间；FIB. 维蛋白原

变量伤前15 min 休克点休克后15 min 休克后30 min 休克后1 h F P R值(min) 4.55±0.61 3.06±0.51 2.86±0.27 2.73±0.23 2.93±0.32 5.62 ＜0.001 PT(s) 12.81±1.01 12.75±0.79 12.15±0.82 12.36±0.79 12.17±0.84 2.59 0.05 APTT(s) 26.64±2.31 25.50±1.76 24.88±2.47 24.65±2.65 24.56±3.05 2.17 0.09 FIB(g/L) 4.86±0.72 4.38±0.62 4.43±0.90 4.31±0.68 4.59±0.77 2.18 0.09 MA(mm) 80.28±2.60 77.21±3.30 77.01±4.20 77.01±6.00 72.37±14.60 2.62 0.12 LY30(%) 1.01±0.92 0.92±0.88 1.18±0.92 0.96±1.10 0.62±0.65 1.31 0.28

2.5 凝血指标变化的相关性分析 Pearson相关性分析显示，APTT与心率(-0.301)、DBP(0.267)、SBP(0.254)、MAP(0.241)明显相关(P＜0.05)； R值与心率(-0.358)、SVI(0.342)、SBP(0.312)、M A P(0.2 5 4)明显相关(P＜0.0 5)；M A 值与BE(0.450)、LAC水平(-0.425)、K+浓度(-0.412)、pH值(0.328)、Ca2+浓度(0.297)、SVI(0.229)明显相关(P＜0.05)。总体来说，APTT和R值与血流动力学指标明显相关，MA值与血气指标明显相关，未发现PT与其他指标明显相关(表4)。

表4 长白猪凝血指标变化的相关性分析(r值)Tab.4 Correlation analysis of coagulation index changes in Landrace pigs (r)

3 讨论

ATC一直是国内外急重症领域研究的热点，由于凝血系统、纤溶系统异常在创伤后尤其是以大出血为主要原因的严重创伤后存在多种表现形式，如内源性凝血系统激活所表现的高凝状态[13]、大量液体复苏或凝血因子消耗导致的低凝状态[17]，以及纤溶系统改变导致的纤溶亢进或纤溶关闭状态[10]等，以上各种病理生理过程相互交织，使得对于严重创伤出血的救治决策面临重大挑战[18]。在军事背景下，由于创伤程度及救治难度增加，ATC发生率较平时更高。研究显示，在枪弹伤及爆震伤中ATC发生率分别为37%和50%[19]，高于在民事创伤中的30%[20]。本研究建立猪枪弹伤失血性休克模型，通过严重出血诱导失血性休克，造成严重的组织灌注不足和酸中毒，实验动物每千克体重出血量为(25.90±2.67) ml，与Debarros等[12]报道的同类模型失血量一致，约相当于丢失循环血量的35%。

在血流动力学方面，本研究结果显示，APTT和R值与血流动力学变化明显相关，其中APTT主要反映内源性凝血系统活性，表明创伤早期内源性凝血功能的激活可能与血流动力学恶化有关。有研究发现，血流动力学效应可能是血栓形成的病理生理机制：首先，血压下降导致的血流减慢是血栓形成的重要物理因素；其次，血流减慢可进一步促进血小板边缘化，并增强血小板与血栓的相互作用[21]。一般认为，在失血性休克中低体温、酸中毒和凝血功能障碍是导致死亡的三联征[22-23]，而本研究中动物体温呈逐步上升趋势，原因可能为本实验是在野外环境中进行且未对动物体温进行任何干预，因此受到环境影响较大，体温上升可能与环境温度有关。同时，与相关研究报道相比[24-26]，本研究中动物体温波动仍处于正常范围内，未出现高热及低温现象，体温变化与凝血指标也未呈现明显相关性。

在血气分析方面，本研究结果显示，实验动物出现持续加重的代谢性酸中毒。多项研究证实，乳酸与碱剩余是评估失血性休克严重程度及组织灌注不足的良好指标，与病死率增高等不良预后相关[27-29]，欧洲创伤后大出血和凝血功能障碍管理指南(第5版)明确建议将乳酸和(或)碱剩余作为估计和监测出血和休克程度的敏感指标[30]。同时K+浓度在30 min至1 h阶段出现明显升高，说明在休克30 min后，由于持续组织灌注不足导致严重缺氧，可能已发生大量组织坏死，从而导致血钾快速上升[31]。本研究结果表明，若组织灌注不足持续得不到纠正，在休克后30 min可能会发生快速恶化，出现血压进一步下降、严重酸中毒、高钾血症等严重并发症，与国外相关研究结果一致[32]。在细胞水平上，大量失血后氧气输送不足以满足机体代谢，随着缺氧进一步加重，乳酸、无机磷酸盐和氧自由基开始蓄积，线粒体DNA和甲酰基肽等损伤相关生物片段的释放将进一步引发全身炎症反应，细胞稳态最终被打破，导致细胞凋亡或坏死，从而引起细胞大量死亡。本研究结果显示，MA值与BE、LAC水平、K+浓度和pH值明显相关，说明严重的组织灌注不足及酸中毒与MA值明显相关，而MA值反映了血栓强度，并与纤维蛋白原和血小板功能相关[33]。由此推测，纤维蛋白原消耗、血小板功能减退等可导致血栓强度下降，而这种病理状态会随着组织灌注不足的严重程度增加而加重。White等[33]的动物实验结果显示，在无任何复苏的情况下，随着组织灌注不足加重，纤维蛋白原水平和MA值均明显降低，表明随着创伤性失血性休克的加深，纤维蛋白原消耗和血栓强度下降可能是凝血功能障碍早期的表现形式。

在凝血功能方面，实验动物在休克后1 h内出现持续高凝状态，PT、APTT及R值均持续下降。该结果与国内外相关研究结果一致，如Chai等[34]全面评估了冲烧复合伤的SD大鼠在伤后72 h的凝血变化，结果显示，实验动物在伤后24 h内处于高凝状态；Park等[35]在钝挫伤患者中发现早期高凝状态与损伤的严重程度呈正相关。值得注意的是，虽然本研究中实验动物整体上在创伤后处于高凝状态，但在不同时间点的原因可能有所不同，在创伤发生到休克后10 min内，实验动物主要表现为纤维蛋白原水平与MA值下降，可能是急性失血导致凝血原料大量流失以及内源性凝血系统激活，从而呈现高凝状态，但血栓强度较低；在休克发生后10 min至1 h，LY30值出现明显下降，表明此阶段可能出现了纤溶关闭的状态，而这种纤溶关闭状态进一步加重了高凝状态。纤溶关闭是近年来提出的一种纤维蛋白溶解表型，主要表现为与纤溶亢进相反的一系列抑制纤维蛋白溶解的状态[36]。Moore等[37]通过观察严重创伤患者，描述了三种不同的纤维蛋白溶解表型并以血栓弹力图LY30值的大小进行分类，即纤溶亢进(LY30＞3.0%)、生理性纤维蛋白溶解(LY30 0.8%～3.0%)及纤溶关闭(LY30＜0.8%)。与创伤性生理性纤维蛋白溶解的患者相比，纤溶关闭和纤溶亢进患者的病死率均较高，分别为23%和34%。有研究报道，在严重创伤患者中纤溶关闭是最常见的类型，约占46%，生理性纤溶及纤溶亢进分别占36%及18%[14]。Prat等[13]在猪初级爆震伤模型中发现，即使没有出现失血性休克，严重组织损伤也会引发高凝状态和纤溶关闭，表明高凝状态在严重创伤中普遍存在，而这种状态的病理基础可能为纤溶关闭。导致创伤后纤溶关闭的机制仍不明确，一项针对脓毒症引起凝血功能紊乱的研究发现，血浆游离DNA可能有助于抵抗纤维蛋白溶解，这些游离DNA片段与组蛋白共定位，被认为是脓毒性休克中微血管血栓形成的驱动因素[38]。目前，在军事医学及院前环境中，多项研究建议在创伤早期尤其是1 h内应用氨甲环酸进行抗纤溶治疗，以降低死亡风险[39-42]。但本研究结果显示，在严重创伤早期可能需要有选择性地进行抗纤溶治疗，对于以高凝为主要表现的个体应避免加重纤溶关闭状态。

本研究中动物模型存在一定局限性。目前ATC的定义为严重创伤患者早期INR值＞1.2或1.5[15,43]，即呈现明显的出血倾向，而本研究中所有创伤动物在1 h内仍然以高凝为主，并未产生经典意义上以纤溶亢进为主要表现的ATC，这可能与以下因素有关：①与健康人群相比，猪血液系统本身处于相对高凝状态[44-45]，猪血液中蛋白C水平只有人类的36%，而血小板及纤维蛋白原水平却显著高于人类。有研究发现，激活的蛋白C(active protein C，APC)参与并促进了纤溶亢进的发生，且可能介导了创伤后内源性急性凝血病(endogenous acute coagulopathy，EAC)[46]。由此可见，猪本身可能存在纤溶不足而处于高凝状态，猪创伤模型难以呈现典型的以纤溶亢进为表型的ATC。在今后的研究中需引入不同种类的动物模型，如羊及犬类等。②本研究观察时间窗为1 h，由于大量出血及组织损伤导致早期机体的内皮系统及凝血系统被激活，机体可能在短时间内处于高凝状态。但随着时间延长，凝血因子及纤维蛋白原大量消耗伴随纤溶系统的进一步激活，可能会呈现更为明显的出血倾向。因此，在今后的研究中可延长观察时间，进一步明确凝血系统的阶段性变化。③本研究在整个观察过程中未进行任何形式的液体复苏，而在实际创伤救治过程中，常由于早期大量的晶体液复苏导致稀释性凝血病，这也成为医源性ATC的发生机制之一。近年来，损伤控制性复苏(damage control resuscitation，DCR)提出了限制性液体复苏的概念[32]，同时强调血液制品在复苏中的重要作用[47-48]。在后续研究中可探讨不同种类液体复苏对凝血系统的影响，这对创伤患者的复苏策略选择将更具现实意义。④本研究选取了5个时间点分析实验动物相关变量的变化趋势，并不能完全揭示其连续变化规律，在今后的研究中可以缩小观察间隔，以进一步提高结果的准确性。

综上所述，本研究结果表明，在严重创伤失血性休克后1 h内，血流动力学及血气指标均出现阶段性的变化，尤其休克后30 min可能是恶化的拐点；凝血系统整体处于高凝状态并伴有血栓强度明显下降；从休克后10 min开始，纤溶系统受到抑制并出现纤溶关闭状态，可能进一步加重高凝状态。