葫芦素B对三阴乳腺癌HCC1806细胞增殖凋亡及Wnt信号通路的影响

史 莹，王 丹，姜朋丽，万晓雨，刘 斌

(吉林大学第二医院 乳腺外科，吉林 长春130041)

三阴乳腺癌 (Triple Negative Breast Cancer,TNBC) 为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)三者蛋白表达均阴性的乳腺癌，占乳腺癌总数的 15%，具有高侵袭性和易转移复发的特点[1]。由于 TNBC 目前无有效的放疗、内分泌及针对HER-2的分子靶向治疗，使得寻找包括中药提取物在内的新的干预措施显得至关重要。葫芦素B(Cucurbitacin B)是一种高度氧化的四环三萜类化合物，存在于葫芦科植物及其他科属多种植物中。最新研究发现低浓度的葫芦素 B 可以抑制肺癌、结肠癌等肿瘤的发展[2，3]，但关于葫芦素B对TNBC 的作用及机理仍不清楚。本实验体外研究葫芦素B对TNBC细胞增殖和凋亡的影响，为TNBC临床治疗中葫芦素 B 的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料三阴乳腺癌细胞株HCC1806购于中科院上海细胞所；葫芦素B购于南京景竹生物科技有限公司；DMEM 高糖培养基和FBS胎牛血清购于美国Gibco公司；胰蛋白酶溶液、MTT和DMSO试剂购于美国Amresco公司；BCA 蛋白含量检测试剂盒和Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物公司；β-catenin、 Gsk3β、 CyclinD1、 P53、 Caspase-3 和β-actin一抗购于美国Abcam公司；HRP 标记的二抗购于武汉博士德生物工程有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒和Hoechst33258染色液试剂盒购于海门市碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养HCC1806细胞常规培养于DMEM高糖培养基(含10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素)，在37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养；当细胞生长密度达80%-90%，弃除旧培养基，加入 0.25% 胰蛋白酶溶液消化传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 MTT实验将HCC1806 细胞接种于96孔板(500个/孔)，加入含不同浓度的葫芦素B，根据浓度不同分为3组(浓度分别为0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同时设空白对照组，每组设 5个复孔，常规培养 48 h后每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，吸除孔内培养基，每孔加入150 μl DMSO，低速摇床 30 min。酶标仪 490 nm 波长下检测每孔吸光度OD值，计算细胞增殖抑制率，实验独立重复3次。细胞增殖抑制率=[1- 实验组OD值/对照组OD 值]×100%。

1.4 流式细胞术将HCC1806细胞接种于6孔板(5×103个/孔)，分别加入不同浓度的葫芦素 B，根据浓度不同分为3组(浓度分别为 0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同时设空白对照组，常规培养48 h后收集细胞，Annexin V和PI双染料孵育后Guava easy Cyte5微流式细胞分析仪检测细胞凋亡。

1.5 Hoechst33258染色实验将HCC1806细胞接种于6孔板(5×103个/孔)，分别加入3组不同浓度的葫芦素B(浓度分别为0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同时设空白对照组，常规培养 48 h后加入10%甲醛，固定20 min后加入Hoechst33258染色液，用荧光猝灭液封片，荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态。

1.6 Western blot检测使用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液沸水浴5 min。12% SDS-PAGE 电泳后 200 mA 电转至 PVDF 膜上，4℃ 下 BSA 封闭过夜，室温 TBST 洗涤后，β-catenin、Gsk3β、CyclinD1、P53、Caspase-3和β-actin一抗孵育2 h，继续洗涤后 HRP 标记的二抗孵育2 h，ECL 显色。

2 结果

2.1 葫芦素B对HCC1806细胞增殖的影响MTT 实验结果显示3组不同浓度的葫芦素B(0.5、2.5、12.5 μmol/L) 对HCC1806细胞的增殖抑制率分别为(29.8±3.5)%、(41.7±1.6)%、(57.8±6.6)%。统计分析显示：不同浓度用药组之间及各用药组与对照组之间比较均具有差异统计学意义(P<0.05)。结果表明：葫芦素B对HCC1806细胞的增殖有明显的抑制作用，同时具有浓度依赖性。

2.2 葫芦素B对HCC1806 细胞凋亡的影响采用Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术结果如图1所示，空白对照组(0 μmol/L)及葫芦素 B 0.5 μmol/L组、2.5 μmol/L组、12.5 μmol/L组细胞凋亡率分别为(5.1±0.6)%、(14.9±2.4)%、(31.2±2.8)%和(41.1±4.0)%。结果显示：HCC1806 细胞的凋亡率随着葫芦素 B 药物浓度增加而增加。统计分析显示：与空白对照组比较，葫芦素 B 诱导细胞凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果表明：葫芦素B具有促HCC1806细胞凋亡的作用。

图1 流式细胞术检测葫芦素B对HCC1806细胞凋亡的影响

2.3 葫芦素B对HCC1806细胞凋亡形态学的影响Hoechst33258染色实验结果如图2所示，在荧光显微镜下，空白对照组细胞核被Hoechst染色呈现较均匀的蓝色，而在葫芦素B处理后HCC1806 细胞核可出现凋亡形态学的改变，即浓染颗粒状荧光、碎片状荧光和不规则椭圆形荧光的出现，程度随着葫芦素B浓度的提高而增加(P<0.05)。

图2 Hoechst33258染色检测葫芦素B对HCC1806细胞凋亡形态学的影响

2.4 葫芦素B对Wnt信号通路及下游关键蛋白的影响Western blot结果如图3所示，葫芦素 B 处理后HCC1806 细胞较空白对照组，β-catenin 和 CyclinD1 蛋白表达量显著降低(P<0.05)，Gsk3β、 P53和Caspase-3蛋白表达量显著升高(P<0.05)，而葫芦素B 0.5 μmol/L组、2.5 μmol/L组、12.5 μmol/L组3组组间比较，β-catenin、 Gsk3β、 CyclinD1、P53 和 Caspase-3 蛋白表达量的变化出现浓度依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 Western blot检测葫芦素B对Wnt信号通路及下游关键蛋白的影响

3 讨论

乳腺癌是女性最常见且高度异质性的肿瘤，在组织学形态、免疫学表型以及治疗效果上具有很大的差异性，使得患者预后较差[4,5]。本研究发现三阴乳腺癌细胞株 HCC1806 经过低浓度葫芦素B处理后，细胞增殖就受到了明显抑制，而凋亡能力显著提升，随着葫芦素B 浓度的增加，也对HCC1806 细胞的恶性生物学行为抑制能力不断增加。本研究初步结果证明：低浓度葫芦素B可显著抑制三阴乳腺癌细胞株HCC1806的恶性生物学行为。

以往研究证实在乳腺癌发病调控机制中，Wnt/β-catenin信号通路发挥着重要的作用。经典Wnt/β-catenin信号通路中Wnt分泌蛋白通过跨膜受体蛋白和Dsh/Dvl松散蛋白将信号传至Gsk3β，Gsk3β磷酸化后导致“APC-Axin-Gsk3β复合物”无法形成，阻断了β-catenin 蛋白的降解，β-catenin 蛋白胞质内聚集并进入核内，与TCF/LEF结合后可调控下游靶基因发挥生物学作用[6]。Shuang 等研究发现β-catenin与TCF/LEF结合形成复合物后可作用于 CyclinD1启动子导致CyclinD1表达上调，CyclinD1作为细胞周期基因，其主要功能是促进细胞增殖[7]，同时复合物亦可活化Caspase 家族，其中Caspase-3活化为细胞进入不可逆凋亡的重要标记，Caspase-3活化水平的升高可促进细胞凋亡的发生[8]。

本实验对葫芦素B抑制三阴乳腺癌细胞株HCC1806的增殖促进其凋亡的分子机制进行了初步研究，发现葫芦素B处理HCC1806细胞后，细胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表达量显著降低，而Gsk3β、 P53和Caspase-3蛋白表达量显著升高。我们的实验结果提示：葫芦素B可抑制Wnt/β-catenin信号通路的表达，并影响其下游的关键蛋白CyclinD1、P53和Caspase-3的表达抑制三阴乳腺癌细胞株HCC1806 细胞的生长并促进其凋亡。