肾癌组织中HIST1H3B的表达变化及意义

陈佳琦，孙伯尧，何成彦，岳新颜，李洪军*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.长春中医药大学附属医院)

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，约90%发生在肾实质[1]，发达国家和男性发病率较高，其原因尚未明确[2]。尽管肾癌较肺癌、结直肠癌等疾病发病率低，但在泌尿生殖系统癌症中死亡率最高[1]，因此，早期诊断和筛查成为当前研究的重点之一，包括尿液检查、超声、肿瘤标志物等[3]，由于假阴性、假阳性和过度诊断的发生，使得肾癌的防治工作充满挑战。本次实验旨在探究HIST1H3B在肾癌组织中的表达及临床意义，为肾癌的诊断提供可能的、新的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验样本取自吉林大学中日联谊医院2018年1月到2018年12月经病理学检查并诊断为肾透明细胞癌的患者共计18例，采集标准为：肿瘤TNM分期为Ⅲ期，同时未经化疗、放疗或生物治疗等任何干预治疗，并排除已发生远端转移的新鲜肾透明细胞癌组织标本，同时采集癌旁标本。将符合采集标准的样本彻底使用生理盐水冲洗后进行液氮冷冻，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1提取与测定样本总蛋白 取出冰冻保存的样本放入PBS中清洗，并在液氮中充分研磨，完成后在已成粉末的样本中加入适量RIPA裂解缓冲液，室温置于冰上充分震荡混匀，随后加入适量RNA酶和DNA酶以去除样本中游离的RNA和DNA，再以12 000 rmp、4℃、15 min的设定进行离心，取得的上清液即为总蛋白。提取总蛋白后进行总蛋白的测定，该过程需采用BCA蛋白定量试剂盒测定该样本总蛋白在562 nm波长处的吸光度，根据标准曲线计算出样本蛋白浓度。

1.2.2制备蛋白水解多肽混合物 取出妥善保存的总蛋白样本，用5倍体积的50 mmol/LNH4HCO3溶液进行稀释，随后加入适量1 mol/L二硫代苏糖醇(DTT)至溶液浓度为20 mmol/L，置于56℃避光条件下反应1 h，再冷却至室温并加入适量1 mol/L的碘代乙酰胺(IAM)至溶液浓度为50 mmol/L，在室温避光条件下反应30 min。完成后在该反应体系中加入蛋白：胰酶比例为50∶1的测序级胰酶，置于37℃的水浴箱中12 h，所得产物分装后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3二维色谱质谱联用技术 取出上述步骤中分装冻存的样品，加入0.1%FA溶液进行溶解，分装样品各取50 μg用于色谱上样，再使用LTQ XL离子肼质谱仪进行蛋白质组学分析。

1.2.4免疫印迹试验 用免疫印迹试验分别检测目标蛋白HIST1H3B在肾癌组织和癌旁组织的表达情况，以验证二维色谱与质谱联用技术的分析结果。

1.2.5仪器与试剂 PBS、苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解缓冲液、RNA酶、DNA酶、离心机、BCA蛋白定量试剂盒、NH4HCO3溶液、DTT、IAM、测序级胰酶、Agilent 1200高效液相色谱仪、伯乐垂直电泳仪、LTQ XL离子肼质谱仪、HIST1H3B单克隆抗体。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析肾癌组织和癌旁组织的结果

本次试验中，癌组织样本和癌旁组织样本中同一蛋白的丰度以谱图数的差异来衡量，同时满足两个样本中蛋白谱图数比值≥1且该对样本谱图数差值≥72的蛋白定义为差异蛋白。按上述定义标准，检测出包括14个上调表达蛋白，7个下调表达蛋白，共计21个差异表达蛋白，见表1，其中目标蛋白HIST1H3B为上调表达蛋白，HIST1H3B质谱图结果见图1。

表1 肾癌组织及癌旁组织差异蛋白

图1 HIST1H3B质谱图结果

2.2 免疫印迹试验分析HIST1H3B在肾癌和癌旁组织中的表达结果

使用免疫印迹试验分析HIST1H3B在肾癌和癌旁组织中的表达情况，结果见图2。结果表明HIST1H3B在肾癌组织中表达量高于其配对的癌旁组织，进一步验证了LC-MS技术分析结果。

图2 免疫印迹试验分析HIST1H3B在肾癌和癌旁组织中的表达

3 讨论

组蛋白家族主要包括H1、H2B、H3、和H4[4]，共同参与核小体的构成[5]。其中组蛋白H3对于维持染色体正常结构具有非常重要的意义[6]。组蛋白H3主要有H3.1、H3.2、H3.3、着丝粒蛋白-A和睾丸特异性组蛋白H3t等5种变体。组蛋白H3.1沉积在染色质中，通常依赖DNA复制，并发生在CAF-1分子伴侣介导的过程中[7]。已有研究表明，组蛋白基因在乳腺癌、肝癌中患者中均为高表达[4，8]，同时组蛋白基因可能会成为检测乳腺癌、喉癌、宫颈癌患者生存的预后指标[4，9，10]，更有研究表明，组蛋白H3变异体的突变可能是弥漫性桥脑神经胶质瘤(DIPG)的潜在特异性治疗靶标[11]，可能为相关疾病提供新的治疗方向。

目前关于HIST1H3B的研究大部分与共价修饰方面有关，而关于组蛋白与癌症的关系、组蛋白在癌症中可能存在的作用等方面的研究较少，有待进一步探究。

近年来，我国乃至全球范围内肾癌发生率呈现出逐年上涨的趋势[12]，由于早期诊断和筛查的不完善，目前主要依靠影像学手段明确诊断。已有大量研究证实，DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA表达等表观遗传性改变在肾癌发生过程中起重要作用[12]。因此在未来科研工作中探究肾癌相关基因遗传学方面显得尤为重要。集合管癌(CDC)是一种罕见的肾癌亚型，预后差，Wach等人提出组蛋白基因HIST1H3B(H3.1)在集合管癌中表达上调[13]，这一研究结果可能为肾癌的早期诊断提供新的思路，但由于临床数据有限及亚型的局限性，不能说明HIST1H3B在其他亚型肾癌中的表达情况。本研究应用二维色谱-质谱联用技术证明了HIST1H3B在肾癌中的表达量上调，且在癌组织中表达量明显高于其配对的癌旁组织，不排除HIST1H3B与肾癌的发生发展有关，但具体机制尚未完全明确，仍需进一步研究。