小鼠胚胎腭突上皮细胞初级纤毛生长规律的研究

陈珏蓉,王 新,陈 尚,宋庆高,何 苇

0 引 言

非综合征性唇腭裂是新生儿颌面部常见的出生缺陷，影响患儿容貌语音等诸多方面，我国新生儿患此病发生率达1.67‰左右[1]。腭的正常发育涉及多种信号网络因子[2]，研究证实与腭发育相关的Shh信号在其他组织细胞中依赖初级纤毛发挥作用[3]，其他关键信号因子，如Wnt信号传导也与初级纤毛相关[4]。已有研究证明初级纤毛存在于小鼠的胚胎腭突间充质细胞上[5]，然而初级纤毛在小鼠胚胎腭突上皮细胞如何分布尚不清楚。本文旨在观察初级纤毛在小鼠胚胎腭突上皮细胞的分布变化情况，为研究胚胎腭突上皮细胞中依赖初级纤毛传递的相关信号提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料SPF级C57BL/6J小鼠，由陆军军医大学(原第三军医大学)实验动物中心提供，许可证号：SLXR (渝) 20070005。适应性饲养1～2周，每日给予光照和黑暗时间各为12 h，控制相对湿度30%～60%，控制温度18～25 ℃，动物饲料、饮用水和垫料均已消毒；实验作用扫描电子显微镜，为日本HITACHI品牌，S-3400型；透射电子显微镜，为日本HITACHI品牌，H-7650型；激光共聚焦显微镜，为德国Leica品牌，TCSSP2型；抗小鼠αα-tubulin单克隆抗体(32-2700，Thermo 美国)，抗小鼠γ-tubulin单克隆抗体(PA-5-34815，Thermo 美国)，Alexa 555山羊抗鼠IgG(H+L，A-21424，Thermo 美国)，Alexa 488 山羊抗兔IgG(H+L，A-11034，Thermo 美国)，抗荧光淬灭封片液(含DAPI，S36964，Thermo 美国)。

1.2实验方法

1.2.1 样本采集以雄雌数为1∶2比例合笼实验小鼠，于第2天上午8:00检查雌鼠的阴道内有无精栓，称重标记有精栓的雌鼠，标记：妊娠0天(embryo day 0,ED0)，并单独饲养；于ED10再次称重该鼠，重量增加≥2 g且腹部明显隆起的小鼠确定为已孕继续饲养，然后收集ED12.5、ED13.5、ED14.5和ED15.5的孕期小鼠为实验对象。

1.2.2扫描电镜标本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5时的实验小鼠，均行安死术，取胚胎头部腭以上部位组织先后置于预冷3%戊二醛和新鲜配置的1%锇酸中各固定2 h后，然后将组织进行梯度乙醇以及叔丁醇脱水，对样品先行冷冻处理，再抽真空，之后行干燥处理，同时粘台，最后样本行导电处理后扫描电镜观察拍照。

1.2.3透射电镜标本制作与观察各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5时的实验小鼠，均行安死术，取胚胎头部腭以上部位，组织先后置于预冷3%戊二醛和新鲜配置的1%锇酸中分别固定2h和1.5h。用梯度乙醇行脱水处理，用SPURR树脂完成浸透包埋处理，修块后以平行皮肤方向切取50 nm厚超薄切片，铺片并干燥，甲苯胺蓝染色，观察定位后加膜后的200目铜网捞片，然后用二氧化铀-醋酸铅-柠檬酸盐染色超薄切片30 min，最后透射电镜观察拍照。

1.2.4激光共聚焦显微镜标本制作各取2只ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5时的实验小鼠，均行安死术，取胚胎头部并快速将该组织放入4%多聚甲醛固定液中固定>2 h后，然后脱水石蜡包埋。待连续切片结束，实施免疫荧光(IF)染色操作：一抗孵育(抗小鼠αα-tubulin与抗小鼠γ-tubulin单抗)(1∶200)；二抗孵育(羊抗鼠IgG，红色荧光；山羊抗兔IgG(Alexa 488)，荧光显绿色)(1∶500)；DAPI显色：用DAPI染液行3 min处理，待封片完成，借助激光共聚焦显微镜，完成观察与拍照。

2 结 果

2.1 扫描电镜观察结果扫描电镜下各时间点小鼠胚胎腭突组织表面均较完整，无明显缺损，细胞间连接致密清晰，腭突上皮细胞形似半球，大小基本一致。ED12.5和ED13.5小鼠的前腭突和两侧侧腭突轮廓清晰未融合，ED14.5小鼠侧腭突在腭中线处由前向后部分融合，ED15.5两端腭突大致融合。在ED12.5、ED 13.5与ED 14.5，能够观察到，上皮细胞表面数量较多、长度<1 μm的伪足样结构，ED12.5、13.5、14.5小鼠腭突部分上皮细胞表面可见长约2～8 μm的指状突起，即为初级纤毛，纤毛膜细胞膜连续，ED12.5纤毛数量较ED13.5偏少， 观察发现ED15.5腭突表面无纤毛。见图1。

a、b、c、d：分别为ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

2.2透射电镜观察结果通过透射电镜，能够观察到不同时间段小鼠腭突上皮细胞均具备连续完整的胞膜，以及均匀的细胞质，且于细胞质内能够清晰观察到诸如线粒体等未发生肿胀的其他细胞器骨架，细胞核无膨胀，核膜完整，核仁呈圆形且质地均匀。ED12.5初级纤毛基部清晰可见，位于小鼠腭突上皮细胞内部，ED13.5小鼠腭突上皮细胞可见初级纤毛的基部、纤毛膜和微管，纤毛长度约为1～3 μm，直径在0.25～0.5 μm上下，纤毛基部深染，纤毛膜连接着细胞膜，纤毛最下端微管向其最上端延伸，ED14.5小鼠腭突上皮细胞上清晰可见纤毛结构，达3～4 μm左右的长度，呈0.25～0.5 μm左右直径，ED15.5腭突上皮细胞表面则无初级纤毛。见图2。

2.3激光共聚焦显微镜观察结果激光共聚焦显微镜下可见红色荧光为细胞α微管蛋白，绿色荧光为细胞γ微管蛋白。在ED12.5、ED 13.5与ED 14.5这3个时间段上，大部分初级纤毛处在实验动物腭突腭中嵴上皮细胞，在荧光反应上，纤毛最下端与体部各显示为绿色、红色 ，见图3，在ED15.5时间段，实验动物腭突上皮细胞表面没有发现显示上述荧光反应的初级纤毛的存在。

a、b、c、d：分别为ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

a、b、c、d：分别为ED12.5、ED13.5、ED14.5、ED15.5

3 讨 论

哺乳动物体内多数细胞都有纤毛分布这一发现可追溯至100多年前，然而长期以来，均把纤毛视作一类退化结构，近些年研究发现初级纤毛是细胞功能的主要调节中枢，初级纤毛对于传递细胞外的机械和化学信号到细胞内至关重要，而且能够调控细胞分化和增殖，以及细胞极性[6]。

初级纤毛属于一类细胞器，其构成的基本单位为微管，它从细胞表面突出，起蜂窝天线的作用[7]。初级纤毛没有中央微管，即9+0结构，属于非运动性纤毛，众多研究结果均显示，在显著影响机体发育的大量信号通路传递方面，初级纤毛扮演者一定角色，包括Shh、Wnt、TGF、PDGFRα、Notch和RTK等信号通路，以及发挥通过细胞外基质受体的信号传递、嘌呤能受体和离子通道等功能[3-4，8]。若纤毛功能或结构失常，会阻止部分发育关键信号途径顺利传导，由此导致包括呼吸障碍，肥胖，失明、肾功能异常，骨骼畸形、智力迟钝等等缺陷[9]，甚至引起一系列严重的遗传综合症。

研究证实哺乳动物Hedgehog(Hh)信号通过初级纤毛发挥作用，几乎所有的Hh信号的核心转导组件都聚集在初级纤毛上[8]，与Wnt信号传导也有一定关系[4]，异常的Wnt信号传导可影响细胞的增殖与分化[10-11]。Sonic hedgehog(Shh)为Hh的其中一亚类，研究显示Shh在腭发育关键时期发挥重要作用[12]，特定时期小鼠胚胎腭突上皮细胞有Shh的广泛表达[13]。那么小鼠腭发育期间Shh信号发挥作用是否依赖于初级纤毛还不得而知，要解决这个问题首先要弄清小鼠腭突上皮细胞初级纤毛的分布情况，才能进行进一步深入的研究。

扫描电镜显示，ED12.5、ED 13.5、ED 14.5实验动物的腭突上皮细胞在腭突表面呈突起状，其形似半球，清晰呈现出紧密的胞间联系，此现象相符于其它研究人员借助扫描电镜所得结果，可见取材以及之后的样本制作行为，未伤及小鼠腭突[14]。借助透射电镜，能够发现小鼠腭突细胞具备完好、正常的胞膜，且显示出均匀的胞质，细胞内细胞器(包括线粒体等)骨架清晰，且未见肿胀，细胞核与核膜皆正常，核膜严密贴合核，核仁似圆状，具均匀质地，可见，透射电镜标本制备行为，未导致胞内细胞器受损，进而推断此次观察到的诸如初级纤毛等其它细胞器与客观状况相符[15]。扫描电镜和透射电镜观察到的纤毛长度不一致，可能是由于标本制作观察过程中并不是每个观察镜像或切片都展示了完整的初级纤毛，或者初级纤毛正处于合成/解聚的过程，而不能展示其全长[16]。

借助扫描电子显微镜，能够观察到有纤毛状结构分布于一些上皮细胞表面，此类结构长达2～8 μm左右，本研究进一步利用透射电镜进行观察，通过透射电镜发现了初级纤毛内部典型的9+0型微管结构，同时可清晰观察到纤毛基部的轴丝和纤毛膜等结构，在初级纤毛直径与长度等方面，本次观察所得基本相符于全球其它研究人员的此类观察结果[17-18]，说明本研究观察到的纤毛样结构即为初级纤毛。

比较几个时间点的小鼠胚胎腭突上皮细胞，与ED12.5胎鼠相比，在腭突表面初级纤毛量方面，ED13.5小鼠偏多，在此方面，ED14.5小鼠则相较ED13.5小鼠偏少，然而在长度方面，则前者较长，ED15.5小鼠腭突上皮细胞表面无纤毛结构，同时丝状伪足量大幅下降。基于ED12.5～14.5小鼠腭突生长发育特征表现以及此部位上皮细胞内各类信号表达时间[19]，再结合外部环境可导致初级纤毛长度改变的表现[20]，故推测随着腭部发育中各种关键信号的表达和消失，初级纤毛随之见规律性改变，同时其还同腭发育相关主要信号途径有着显著关联性。

由此次研究，可明确ED12.5、ED13.5、ED14.5的小鼠腭突上皮细胞表面有初级纤毛分布，同时发现，实验动物所处发育期不同，此类初级纤毛在数量与形态方面也随之改变，为探究腭发育过程中诸如Shh此类核心信号的传递，及对在胚胎腭部各发育期对应的腭突表面超微结构变化的分析，开辟出新路径。