青藤碱对膀胱癌细胞株T24凋亡及EMT转化的影响

吴 磊，黎 炼，罗志刚，张 涛

0 引 言

膀胱癌属于泌尿系统常见的恶性肿瘤，根据浸润程度不同膀胱癌分为肌层浸润性膀胱癌和浅表性膀胱癌。近年来其发病率和病死率不断增高[1]，具有早期确诊率低、恶化程度高、易复发和远处转移、预后差等特点，且大多数初诊患者为浅表性膀胱癌[2-3]。尽管医疗水平不断提高，但对于转移的浸润性膀胱癌患者，其5年生存率低于10%[4]。膀胱癌的发生、进展以及复发的机制尚未完全明确，如何有效阻止浅表性膀胱癌进展到浸润性膀胱癌，对于膀胱癌患者的预后意义十分重大。因此，寻找能够有效抑制膀胱癌细胞转移的治疗方法，对于控制膀胱癌的进展至关重要。

青藤碱是从中药青风藤中提取出来的一种生物碱活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、抗风湿等多种药理活性[5]。近年来，在抗肿瘤方面，青藤碱在抗胃癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等效果显著[6]。研究表明，青藤碱能通过诱导NCI-H460细胞凋亡来抑制非小细胞肺癌细胞系NCI-H460细胞的增殖；青藤碱还可通过阻断上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)过程来抑制肺癌细胞A549的侵袭[7]。然而，青藤碱对人膀胱癌细胞株T24增殖以及EMT的作用目前报道较少。因此，本研究通过观察青藤碱对膀胱癌细胞株T24增殖、凋亡以及EMT的影响，以期为膀胱癌的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料人膀胱癌细胞株T24购自中科院细胞库，盐酸青藤碱购自湖南正清药业有限公司，MTT试剂购自武汉百浩天生物科技有限公司，Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒、Transwell小室购自北京明阳科华生物科技有限公司，N-cadherin、E-cadherin、Bak、β-actin、Bcl-2、Snial以及Slug抗体购自美国Santa Cruz公司，RPMI 1640、胎牛血清等细胞培养试剂购自上海生物工程股份有限公司，LY294002购自Sigma-Adrich。

1.2 细胞培养与处理将人膀胱癌细胞株T24培养于含10%胎牛血清、1%的青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，环境为37 ℃、5% CO2。当细胞密度达到80%左右时，更换新的RPMI 1640培养基。随后用0.5、1.0、2.0 mmol/L的青藤碱处理人膀胱癌细胞株T24细胞24 h。

1.3 细胞增殖实验待人膀胱癌细胞株T24细胞生长至80%左右时，以3×104个/孔加入至6孔板中，置于培养基中培养24 h，环境为37 ℃、5% CO2。在细胞孔中分别加入含0.5、1.0、2.0 mmol/L的青藤碱的无血清培养基2 mL。24 h后将MTT试剂15 μL分别加入各孔中继续培养4 h，加入DMSO 150 μL ，振荡10 min，使用酶标仪490 nm处检测各孔的吸光度值，并计算细胞活性。每组均设3个复孔。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡收集经过青藤碱处理后的人膀胱癌细胞株T24，用含1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗固定细胞后离心10 min、1000转/min，离心半径8 cm，离心10 min，100 μL Binding缓冲液重悬细胞，混匀后加入10 μL的PI和10 μL Annexin V-FITC溶液，37 ℃避光反应15 min后加入碘化丙啶50 μg/mL进行染色，取样品上流式细胞仪检测。

1.5 Transwell实验稀释基质凝胶，取40 μL加入至Transwell小室中，涂抹均匀后孵育24 h后，将膀胱癌细胞株T24加入至上层Transwell小室中，下层加入含10%胎牛血清的培养基。24 h后将膀胱癌细胞株T24固定于无水乙醇中，加入苏木精-伊红染色15 min，在倒置显微镜下计数进入滤膜下表面的细胞。

1.6 细胞划痕实验将人膀胱癌细胞株T24(8×104个/孔)接种于6孔培养板上培养24 h。当观察到人膀胱癌细胞株T24细胞生长到95%左右时，使用200 μL无菌移液器枪头划伤每个孔，吸去悬浮细胞，清洗干净后加入2.0 mmol/L的青藤碱，置于37 ℃环境下孵育24 h后拍照。利用ImageJ软件分析划痕的边距。

1.7 Western blot分析收集经青藤碱处理后人膀胱癌细胞株T24，加入细胞裂解液，4 ℃反应30 min后离心，6000 r/min，离心半径8 cm，离心30 min后收集上清。通过BCA法检测蛋白浓度后，取10 μL蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，相继加入相应的一抗、二抗，其中先加入一抗后4 ℃孵育过夜，再加入二抗时在室温下孵育2 h，最后加入ECL发光液，进行显影处理。

2 结 果

2.1 青藤碱对膀胱癌细胞株T24增殖的影响MTT检测结果显示，0.5、1.0 、2.0 mmol/L的青藤碱处理24 h后，膀胱癌细胞株T24的细胞活性随着青藤碱的浓度升高而逐渐降低[(100.00±2.52)%、(86.5±5.2)%、(64.5±4.5)%、(53.5±7.2)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。提示青藤碱能够抑制膀胱癌细胞株T24增殖。

2.2 青藤碱对膀胱癌细胞株T24凋亡的影响Western blot结果显示，青藤碱处理膀胱癌细胞株T24后 Bcl-2表达逐渐降低，Bak表达逐渐增高。见图1。0.5、1.0 、2.0 mmol/L的青藤碱处理48 h后，膀胱癌细胞株T24的凋亡率显著增高。见图2。

2.3 青藤碱抑制膀胱癌细胞株T24侵袭与迁移划痕实验结果显示，随着青藤碱浓度增加，膀胱癌细胞株T24的迁移水平呈逐渐下降的趋势，2.0 mmol/L青藤碱最为显著，见图3。Transwell实验结果表明，随着青藤碱浓度增加，膀胱癌细胞株T24的侵袭率呈逐渐下降的趋势，2.0 mmol/L青藤碱最为显著。表明青藤碱能够显著抑制膀胱癌细胞株T24的侵袭与迁移能力，见图4。

2.4 青藤碱抑制PI3K/Akt通路对EMT分子表达的影响随着青藤碱浓度增加，Akt磷酸化水平逐渐降低，见图5。2.0 mmol/L青藤碱处理后，膀胱癌细胞株T24中均出现EMT相关分子E-cadherin表达上调，N-cadherin、Slug和Snial表达下调，提示细胞EMT受抑制。进一步采用PI3K/Akt抑制剂(LY294002)处理细胞结果显示，相较于青藤碱单独处理的细胞，20 μmol/L PI3K/Akt抑制剂LY294002处理的膀胱癌细胞株T24中E-cadherin表达水平显著升高，而N-cadherin、Slug和Snial的表达水平显著降低。见图6。

图 1 不同浓度青藤碱对Bak和Bcl-2表达的影响

图 2 不同浓度青藤碱对T24细胞凋亡的影响

a:0 mmol/L; b:0.5 mmol/L; c:1.0 mmol/L; d:2.0 mmol/L

a:0 mmol/L; b:0.5 mmol/L; c:1.0 mmol/L; d:2.0 mmol/L

图 5 青藤碱对Akt磷酸化的影响

图 6 青藤碱对EMT分子表达的影响

3 讨 论

癌症患者预后与肿瘤复发、转移密切相关[8]。癌细胞增殖到脱离原位癌，癌细胞可进入淋巴和血液系统，转移至远处组织[9]。尽管当前医疗水平不断提高，浸润性膀胱癌的治疗效果已取得了一定的疗效，但对于转移的患者，其5年生存率低于10%[4]。因此，有效控制膀胱癌细胞发生转移也是目前临床膀胱癌治疗的关键。

有研究表明，青藤碱能通过细胞外调节蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路的调控作用，诱导人肺癌NCI-H226、NCI-H460和NCI-H522细胞凋亡[10]。还有文献报道，将青藤碱作用于人肝癌细胞后，青藤碱可上调caspase 3、caspase 9、CAV1和下调SOX2的表达[11]。而青藤碱作用于肝癌细胞后，肝癌细胞内Bcl-2表达下降，Fas的表达升高，最终效应是人肝癌HeG2细胞的凋亡增加，而Bcl-2是凋亡抑制基因，Fas是凋亡促进基因[12]。为了明确青藤碱对膀胱癌细胞增殖凋亡的影响，本研究检测了膀胱癌细胞株T24的细胞活性以及凋亡水平，结果发现不同浓度的青藤碱均能够显著抑制膀胱癌细胞株T24细胞增殖，并可通过抑制Bcl-2表达，促进Bak表达增高诱导细胞凋亡。而考虑到青藤碱在抗肿瘤方面的重要作用，本研究结果与上述研究结果相符。

肿瘤转移涉及细胞的多种生物学功能，尤其是侵袭与迁移，与疾病的恶性程度存在密切联系。肿瘤细胞的侵袭与迁移是指肿瘤细胞从原组织向邻近的宿主组织扩散、转移，往往是反映肿瘤恶性程度的关键[13-14]。研究表明，青藤碱可以抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移，且该效应呈现与青藤碱剂量相关的特点[15]。本研究采用2.0 mmol/L的青藤碱处理膀胱癌细胞株T24细胞24 h后，通过Transwell以及划痕实验检测细胞的侵袭与迁移情况，结果显示其侵袭与迁移水平受到明显抑制。进一步证实青藤碱可以抑制膀胱癌细胞的侵袭与迁移过程。

肿瘤细胞转移扩散至其他组织器官除了涉及细胞的侵袭与迁移过程外，通常还与细胞的EMT过程密切相关[16]。肿瘤细胞发生EMT主要对机体预后产生不良影响主要表现在增强肿瘤细胞侵袭和抗凋亡效应等两个方面[17]。目前监测肿瘤细胞EMT过程主要通过检测细胞黏附分子(如E-cadherin)、EMT相关转录调控因子(Slug、Snial)的表达来实现，其中E-cadherin的表达会减少，而Slug、Snial表达将增加[18]。为了明确青藤碱对膀胱癌细胞株T24PI3K/Akt通路的影响，本研究通过Western blot检测了青藤碱处理前后Akt磷酸化水平的变化。本研究通过2.0 mmol/L的青藤碱处理膀胱癌细胞株T24细胞后，发现膀胱癌细胞株T24细胞内E-cadherin表达上调，而N-cadherin、Slug和Snial表达下调，提示细胞EMT受抑制。

PI3K/Akt是一类重要的酪氨酸蛋白激酶，能够参与多种细胞生理活动的调控[19]。为了进一步明确MAPKs与细胞EMT的关系，本研究采用PI3K/Akt抑制剂处理细胞，结果发现膀胱癌细胞株T24细胞中E-cadherin表达水平进一步升高，而N-cadherin、Slug和Snial的表达水平则显著降低。充分说明青藤碱抑制膀胱癌细胞株T24EMT过程与PI3K/Akt通路抑制有关。

综上所述，本研究初步证实青藤碱能够显著抑制膀胱癌细胞株T24细胞的增殖、侵袭以及迁移能力，并诱导细胞发生凋亡。此外，其还能够通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制膀胱癌细胞株T24细胞发生EMT。这为进一步明确膀胱癌的转移机制，从而开发有效的治疗药物提供了实验依据。