吉非替尼对兔膝骨性关节炎的病理特征及相关因子的影响

谢大伟，张来鑫，李青松，王 静，王 彤*

(1.秦皇岛市中医医院 手足外科,河北 秦皇岛066000；2.青龙县医院 妇产科,河北 青龙066500)

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎，是目前最常见的肌肉骨路系统疾病之一[1]。现阶段，我国OA人数约为3 600万，随着我国人口的老龄化，OA患者的数量逐年增加[2]。使用非甾体类药物可以治疗OA，但非甾体类药物仅能改善患者的疼痛症状，不能抑制软骨破坏的病理过程，同时对患者的运动功能的改善效果也不佳[3]。使用小分子药物抑制OA软骨的降解并促进软骨基质的合成，成为目前治疗OA的有效途径之一[4]。因此现阶段研究可以抑制OA软骨的降解并促进软骨基质的合成的药物具有重要的意义。吉非替尼是一种EGFR受体的抑制剂，可以通过抑制EGFR受体的活性从而提高软骨的自噬水平达到延缓OA的进展[5]。同时吉非替尼也可以抑制OA中相关炎症因子的表达，促进软骨基质的合成[6]。本文旨在研究吉非替尼对兔膝OA的病理特征及相关自噬和炎症因子影响，以期了解吉非替尼对兔OA的作用机理，从而为OA的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性SPF级新西兰大白兔60只，体重(2.5±0.3)kg；购自武汉市万千佳禾实验动物养殖有限公司。所有大白兔均在本院动物中心FPS级实验室饲养，饲养温度20-25℃，相对湿度50%-65%，该实验经过动物伦理委员会批准同意。

1.2 药物与试剂

吉非替尼(易瑞沙；国药准字：J20180014)生产厂家：日本Kagamiishi Plant,Nipro Pharma Corporation；白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒购自上海纪宁酶联科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)试剂盒购自上海基免实业有限公司；白细胞介素-6 (interleukin- 6,IL-6)试剂盒购自美国Sigma 公司；Bcl-2、Bax抗体购自北京傲锐东源生物科技有限公司；Caspase-3抗体购自武汉华联科有限公司；p62抗体购自Sino Biolocgical公司；LC3试剂盒子购自江莱生物有限公司；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司。

1.3 仪器

BS-124s 型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司；TGL-16M低温离心机购自济南来宝医疗器械有限公司； SG-51正置型金相显微镜购自上海光学仪器厂；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统购于以色列DNR公司；LD-66实验室切片机购自长沙益广制药机械公司；流式细胞仪购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1分组及建立模型

将60只大白兔适应性喂养 1 周，随机选15只为空白对照组，其余45只大白兔采用制备成OA模型，制作方法及判断模型是否成功参考陈海霞等[7]研究。具体操作如下：按照40 mg/kg的量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，使用碘伏消毒沿髌韧带内侧切开约大小约为0.5 cm的切口，切断大白兔膝关节前交叉韧带，立即消毒，缝合。空白对照组组仅暴露膝关节不切断大白兔膝关节前交叉翻带，消毒缝合。

1.4.2药物干预

低剂量吉非替尼组造模成功1周后，使用吉非替尼0.4 mg/kg d-1灌胃处理；高剂量吉非替尼组模成功1周后，使用吉非替尼0.8 mg/kg d-1灌胃处理；空白对照组和模型组与低剂量吉非替尼组和高剂量吉非替尼组同时使用等量的生理盐水灌胃处理，各组均处理6周。

1.4.3检测项目

①免疫荧光检测LC3含量

取大白兔股骨内髁所有关节软骨，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成单层细胞后，按照免疫荧光检试剂盒说明操作检测LC3含量。

②炎症因子水平检测

从颈总动脉插管接取3 ml 大白兔血液，严格按照IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒上的操作方法，检测其含量水平。

③流式细胞仪检测大白兔软骨细胞凋亡

取大白兔股骨内所有髁关节软骨，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成单层细胞后，使用恒温离心机保持4℃，离心 5 min 收集细胞；收集细胞后加入 100 μl Binding Buffer 重悬细胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，轻轻混匀；室温避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式细胞仪检测大白兔软骨细胞凋亡情况。

④Western blot 检测大白兔膝骨关节Beclin1、LC3、p62、MMP-13及Adamts5蛋白表达水平

使用机械和裂解液提取大白兔软骨组织蛋白，使用超声破碎细胞，使用离心机离心3 000 r/min离心15 min后，加入200 μl的Loading Buffer 缓冲液，100℃煮沸 10 min；使用BCA法测定蛋白浓度后，使用电泳法提取蛋白提取总蛋白，半干法将蛋白转移到PVDF膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的Beclin1小鼠单克隆IgG、LC3小鼠单克隆IgG、p62MMP-13小鼠单克隆IgG等一抗和HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG二抗，孵育2 h，以β-actin为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

⑤HE染色观察大白兔软骨形态

HE染色观察大白兔软骨形态，取股骨内髁关节软骨修成1 mm×1 mm×1 mm的全软骨层，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脱水、苏木精浸泡、盐酸酒精分化、冲洗、伊红染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，最后中性树胶封片即可。在10×40的倍镜观察大白兔软骨形态。

1.4.4统计学方法

2 结果

2.1 各组大白兔自噬情况检测结果

由图1(A、B)可以看出，相比空白对照组，模型组Beclin1、LC3、p62蛋白表达情况无显著变化(P>0.05)；相比模型组，低剂量吉非替尼组Beclin1、LC3蛋白表达水平显著升高，p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；相比低剂量吉非替尼组，高剂量吉非替尼组Beclin1、LC3蛋白表达水平显著升高，p62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

图1 各组大白兔自噬情况检测结果

2.2 各组大白兔体内炎症因子检测结果

由图2可以看出，相比空白对照组，模型组IL-1β、Il-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；相比模型组，低剂量吉非替尼组IL-1β、Il-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)；相比低剂量吉非替尼组，高剂量吉非替尼组IL-1β、Il-6、TNF-α水平显著降低(P<0.05)。

图2 各组大白兔体内炎症因子检测结果

2.3 各组大白兔软骨降解酶MMP-13及Adamts5表达

由图3可以看出，相比空白对照组，模型组MMP-13及Adamts5蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；相比模型组，低剂量吉非替尼组MMP-13及Adamts5蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；相比低剂量吉非替尼组，高剂量吉非替尼组MMP-13及Adamts5蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

图3 各组大白兔软骨降解酶MMP-13及Adamts5表达

2.4 各组大白兔软骨形态观察

由图4可以看出，相比空白对照组，模型组软骨被破坏程度显著升高，同时软骨组织出现裂缝；相比模型组，使用吉非替尼处理后大白兔软骨结构较完整，软骨细胞形态改变较小且病理程度上的改变明显较模型组轻。

图4 各组大白兔软骨形态观察

3 讨论

自噬可以在一定程度上保护膝关节软骨细胞，在正常膝关节软骨细胞中自噬可以持续激活并保证膝关节软骨细胞在低血供时的能量供应[8]。同时正常程度的自噬可以清除细胞内损伤蛋白质和失去功能的细胞并维持细胞的正常功能和活力[9]。P62 是一种泛素结合蛋白，这种蛋白与蛋白质的泛素化密切相关。P62可以参与细胞信号转导调控及自噬过程[10]。陈飞等[11]研究表明：P62 是反映自噬活性的标记蛋白之一，p62含量越高细胞内自噬水平较低，其含量间接反映自噬小体清除水平。Beclin 1则是PI3K 复合物的亚基同时是自噬体形成所必须的蛋白。本研究发现，相比模型组，低剂量吉非替尼组Beclin1、LC3蛋白表达水平显著升高，p62蛋白表达水平显著降低；说明使用吉非替尼处理后大白兔的自噬能力显著增强，这可能是因为在大白兔膝软骨中P62 与泛素化的蛋白质结合，再与定位于自噬小体内膜上的 LC3 II 蛋白形成复合物，被自噬溶酶体内降解。使得大白兔软骨中的P62蛋白降低，同时相比低剂量吉非替尼组，高剂量吉非替尼组Beclin1、LC3蛋白表达水平显著升高，p62蛋白表达水平显著降低，说明在一定浓度范围内吉非替尼可以增强大白兔膝骨的自噬能力且呈浓度依赖性。俞晨等[12]研究表明：降低关节炎成纤维样滑膜细胞中自噬蛋白LC3I/II、beclin-1的表达可以有效抑制其凋亡，于本研究得出的结论相类似。

临床和动物实验均证明炎症过程在OA软骨降解中起关键作用[13]。炎症因子包括促炎症因子和抗炎症因子两种，促炎症因子水平升高，则体内炎症因子水平降低表明体内炎症反应加剧；相反抗炎症因子升高，体内炎症因子受到抑制，则炎症反应减弱[14]。目前研究较多的促炎性细胞因子包括：TNF-α、IL-1β，IL-6 和IL-8 等[15]；抗炎性细胞因子则包括：IL-4，IL-10等[16]。本研究主要探究了IL-1β、Il-6、TNF-α三种炎性因子，发现相比模型组，低剂量吉非替尼组IL-1β、Il-6、TNF-α水平显著降低，且高剂量吉非替尼组IL-1β、Il-6、TNF-α水平显著低于低剂量吉非替尼组。说明吉非替尼可以有效降低大白兔体内的炎症反应。这可能是因为吉非替尼提可以通过抑制免疫分子的传导，实现抑制炎症因子的分泌，达到抑制炎症的作用，且本实验发现，提高吉非替尼的使用剂量可以有效增强对炎症因子的抑制。聂广辉[17]研究表明：吉非替尼可以减少TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6等炎性细胞因子的表达，与本研究得出的结论相类似。

解聚蛋白样金属蛋白酶-5是自噬的关键基因之一，其高表达说明自噬能力较强。MMP-13是基质金属蛋白酶-13，在炎症性和退行性关节疾病的发生发展过程中通过抑制降解关节软骨外基质实现保护的作用[18]。本研究发现相比模型组，使用吉非替尼处理后大白兔软骨组织中Adamts5和 MMP-13表达水平显著降低。这可能是因为自噬关键基因Adamts5是膜受体EGFR的下游基因，而吉非替尼是一种EGFR受体抑制剂，通过阻滞EGFR受体的实现抑制Adamts5蛋白的表达实现保护大白兔的膝骨的作用。吉非替尼可以促进胶原的合成并且抑制MMP-13的表达来实现抑制关节软骨外基质的降解来保护大白兔的膝骨。祁雷等[19]研究表明：降低骨关节炎软骨组织中MMP-13和ADAMTS-5的表达可使得骨关节炎病情的到缓解相一致。

综上所述，吉非替尼可缓解膝骨性关节炎并降低炎症关因子，且在一定剂量范围内呈剂量依赖性，其作用机制与提高自噬能力、降低炎症反应相关。细胞的自噬涉及到的相关蛋白和信号通路较多，在后续的实验中将进一步探究吉非替尼治疗OA涉及到的信号通路。