外泌体中miR-223的表达对胃癌细胞的生物学影响

王 宁，付立业，隋承光，孟凡东，李 妍*

(1.沈阳市第六人民医院 肿瘤介入综合治疗科，辽宁 沈阳110006；2.中国医科大学附属第一医院 肿瘤研究所，辽宁 沈阳110001)

微小RNA(miRNA)具有调节基因表达的能力，通过与靶mRNA结合调控基因表达。miRNA的检测被广泛应用于恶性肿瘤的诊治[1]。miRNA-223(miR-223)高度保守，既可以作为致癌基因也可以作为抑癌基因在多种肿瘤中发挥作用，miR-223通过靶向调控肿瘤细胞中不同基因的表达及其下游信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移及耐药性等生物学行为。miR-223作为致癌基因还是抑癌基因参与胃癌的生物学功能，目前研究甚少。本文研究血清外泌体miR-223与胃癌相关基因表达的相关性，进一步探讨miR-223在胃癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料

选取2019年1月至2019年12月中国医科大学附属第一医院肿瘤内科收治的100例确诊胃癌患者(病例组)，均未接受放、化疗等治疗；其中男59例，女41例；年龄25-75岁，平均(48.54±10.11)岁。另选取50例健康志愿者(健康对照组)以及50例良性胃病患者(良性疾病对照组)。健康对照组中男26例，女24例；年龄25-65岁，平均(44.23±9.03)岁。良性胃病患者男28例，女22例；年龄20-73岁，平均(47.22±11.13)岁。3组性别构成比和年龄比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2样本采集

采集患者及健康志愿者外周静脉血(5 ml/人)，置于抗凝真空管中，离心留取上清液-80℃保存，待后续实验，采用外泌体试剂盒对剩余血液进行血清外泌体提取。

1.2 方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测研究对象血清外泌体中miR-223的表达水平 Trizol法提取细胞总RNA，逆转录cDNA，反应体系为70℃ 10 min，42℃ 60 min，72℃ 15 min，扩增40个循环，每个标本3个复孔。miR-223上游：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′。

1.2.2外周血细胞因子检测

ELISA法检测患者及对照组外周血中IGF-1R的表达，依据说明书进行。

1.2.3细胞转染

将处于对数生长期的胃癌MKN-28细胞消化后，接种于6孔细胞培养板中，细胞数为5×105/孔。当细胞生长达到40%-50%时，根据Lipofectamine 2000脂质体说明书进行操作，分别将microRNA空白序列(miR-223 NC，NC组)及miR-223模拟物(miR-223 mimic，miR-223 mimics 组)按终浓度为50 nmol/L转染到胃癌MKN-28细胞。细胞转染24h后，应用RT-PCR法检测细胞的转染效率及细胞中miR-223的表达。

1.2.4增殖及侵袭相关基因表达的检测

采用RT-PCR对胃癌细胞增殖及侵袭相关基因进行检测。方法同1.2.1。miR-223引物序列，上游：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游：5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；PTEN引物序列，上游：5′-ACACGACGGGAAGACAAGTT-3′，下游：5′-TCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3′；β-catenin引物序列，上游：5′-AAGTTC TTGGCTATTACGACA-3′，下游：5′-ACAGCACCTTCAGCACTCT-3′；N-cadherin引物序列，上游：5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′，下游：5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAG-3′；E-cadherin引物序列，上游：5′-TCCATTTCTTGGTCTACGCC-3′，下游：5′-CACCTTCAGCCAACCTGTTT-3′；GAPDH引物序列，上游：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游：5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火53℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，扩增40个循环周期，最后延伸72℃ 10 min。每个样本检测3个复孔。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0软件对数据进行分析处理，计量资料用均数±标准差表示，组间数据的差异采用单因素方差分析进行比较，Pearson相关分析检验两变量之间的相关性。P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人群血清外泌体中miR-223和IGF-1R的表达

胃癌患者血清外泌体中miR-223的表达明显低于良性胃病患者和健康对照组(P<0.05)；血清中IGF-1R的表达明显高于良性胃病患者和健康对照组(P<0.05)，如图1。

图1 血清外泌体中miR-223和IGF-1R的表达水平

2.2 miR-223的表达与胃癌分期的相关性

比较不同TNM分期胃癌患者血清中miR-223的表达水平，结果显示Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者血清中miR-223的表达水平明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)，且差异有显著的统计学差异(图2)。

图2 血清中miR-223的表达水平与胃癌分期的相关性

2.3 胃癌细胞系MKN-28中miR-223的表达

采用RT-PCR方法检测细胞中miR-223的转染效率，结果显示，与空白对照组和miR-223 NC组相比，转染miR-223后的MKN-28细胞中miR-223的表达显著增加，且差异有统计学意义(P<0.05)，如图3。

图3 胃癌细胞系MKN-28中miR-223的表达水平

2.4 胃癌细胞中PTEN的表达

为验证miR-223对胃癌细胞增殖的影响，采用RT-PCR检测各组胃癌细胞中增殖基因PTEN的表达，结果显示，miR-223组中PTEN的表达明显高于miR-223 NC组(P<0.05)和Control组(P<0.05)，表明miR-223可以上调PTEN的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖(图4)。

图4 胃癌细胞中增殖基因PTEN的表达水平

2.5 胃癌细胞中侵袭基因的表达

为验证miR-223对胃癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响，采用RT-PCR法检测相关基因的表达，结果显示，miR-223组中β-catenin、N-cadherin和E-cadherin的表达水平均高于miR-223 NC组(P<0.05)和Control组(P<0.05)，揭示miR-223的过表达可抑制胃癌上皮间质转化(图5)。

3 讨论

miR-223在多种肿瘤细胞和组织中高表达，与肿瘤的恶性程度有一定相关性[2]。miR-223通过与肿瘤靶基因及相关信号通路作用，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移侵袭等生物学过程。

图5 胃癌细胞中侵袭基因的表达水平

外泌体(exosomes)具有传递细胞间信号的作用[3]。研究表明，胰腺炎大鼠模型腺泡细胞外泌体中含有大量的miRNAs，参与激活肺泡巨噬细胞，调节炎症反应，可见，外泌体携带的miRNA一定程度可以反映细胞的病理状态[4]。为研究miR-223在胃癌中的作用，本实验检测了血清外泌体中miR-223和IGF-1R的含量，显示，胃癌患者miR-223的表达明显低于良性胃病患者和健康对照组；IGF-1R的表达明显高于良性胃病患者和健康对照组，且miR-223和IGF-1R的含量呈负相关。

胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)是miR-223的一个靶点。miR-223在肝癌患者血清及组织中低表达，而过表达miR-223后，肝癌细胞的增殖明显受到抑制，但其凋亡率增加，同时导致IGF-1R的表达下降[5]。过表达的miR-223通过抑制PI3K/Akt/S6信号通路，还可以增强非小细胞肺癌对厄洛替尼的敏感性，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡[6,7]。这也表明，同一肿瘤细胞中miR-223可以同时调控多个靶点，发挥不同作用。

低表达的PTEN可以引起多种肿瘤的发生，负向调节PI3K/AKT信号通路活性，促进细胞增殖。为验证miR-223对胃癌细胞增殖的影响，本实验设计了miR-223过表达细胞组，miR-223 NC组和Control组，结果miR-223过表达中PTEN的表达明显高于其他两组，表明PTEN作为新发现的与肿瘤关系密切的抑癌基因[8]，miR-223可以通过上调PTEN的表达，抑制胃癌细胞增殖。研究发现，过表达的miR-223与胃癌患者的预后成负相关，miR-223通过下调肿瘤抑制因子EPB41L3的表达，促进细胞的侵袭转移[9]。乳腺癌细胞中miR-223 通过调控FOXO-1的表达，促进细胞的增殖[10]。表明高水平的miR-223与肿瘤侵袭有关，且能促进肿瘤细胞增殖。

miR-223参与调控多种肿瘤细胞的生理过程[11]。上皮-间质转化(Epithelial-stromal transformation，EMT)过程可以导致肿瘤细胞迁移及侵袭能力增强。本实验分析了上皮间质转化相关基因的表达，结果显示，miR-223组中β-catenin、N-cadherin和E-cadherin的表达均高于miR-223 NC组和Control组，揭示胃癌细胞miR-223过表达可抑制胃癌上皮间质转化。EMT过程中，通过切断E-cadherin介导的细胞黏附，诱导N-cadherin的表达和释放β-catenin[12]。

E-cadherin表达降低或缺失可导致上皮细胞间黏附能力的减弱或丢失[13]。β-catenin可与E-cadherin结合共同参与细胞间的黏附，当调节β-catenin的系统失调时，胞浆内游离状态的β-catenin即可参与Wnt信号途径的作用[14]。胃癌发生发展中，E-cadherin与β-catenin的表达也相应出现异常改变[15]。E-cadherin表达减少或丢失是细胞失分化的一种危险因素，也是判定患者预后不良的标志，更是肿瘤侵袭转移的重要原因之一[16]。肿瘤细胞中β-catenin基因突变还可使β-catenin与E-cadherin的结合位点发生异常，不能形成E-cadherin/β-catenin复合体，进而使β-catenin从细胞膜脱离而游离到细胞浆中。

目前，对miR-223的研究日渐增多，明确miR-223在胃癌中的调控机制，将为胃癌患者寻找新的治疗靶点提供更可靠的理论依据。