培养基类型和植物生长物质浓度对王枣子愈伤组织诱导和继代的影响＊

张媛媛，朱智慧，张苗苗，苏 勇，方政宇，孙 伟，薛建平＊＊

（1. 淮北师范大学生命科学学院安徽省特色资源植物利用工程实验室 淮北 235000；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

王 枣 子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan 系唇形科香茶菜属多年生草本植物，学名香茶菜[1]，又被称为蛇总管[2]、铁角棱、山薄荷、痱子草等[3]，其根、茎和叶皆可入药[4]，具有药食两用功能[5]。王枣子广泛分布于河南、安徽、湖北、浙江、广西、江苏等地[6]，“宿州王枣子”成为安徽宿州市获得的地理标志证明商标之一[7]，民间常用于治疗毒蛇咬伤、肺脓疡、恶疮和急性肝炎等疾病[2,8]，具有抑菌消炎、解热镇痛[4]、抗氧化[9-10]和抗肿瘤[11-12]等作用。研究[13-16]表明，王枣子的主要活性成分为王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素等二萜类化合物以及齐墩果酸、熊果酸等三萜类化合物，被誉为“天然植物抗生素”。王枣子因其毒性低、副作用小和安全性高等优点，应用前景较为广阔。

近年来，随着对王枣子药用功能的深入研究，王枣子的需求日益增大。由于野生王枣子的生长环境限制、生长速度慢和过度采挖，导致王枣子野生资源骤减。因此，利用植物细胞工程技术开展细胞组织培养法大规模生产王枣子有效成分研究具有重要的现实意义。利用细胞悬浮培养体系大规模生产植物细胞内的有用次生代谢产物首先要获得疏松的愈伤组织，这是进行植物细胞悬浮培养的重要前提。目前，对于王枣子的研究主要集中在成分鉴定(如王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素[13-15]和三萜类鉴定[16,24])、抗氧化活性的研究[10]、提取物总黄酮的治病机制[25]、临床抗菌作用[4]、王枣子乙素新型给药系统的制备[26]、种子萌发条件的探究[27]、试管苗的继代快繁[29]和再生体系的构建[30]等方面。刘芳等[28]以王枣子的茎、叶筛选了外植体的类型，在此基础上研究了诱导王枣子愈伤组织最佳NAA（α-萘乙酸）与2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的浓度配比，在试验中我们发现，该配方得到的愈伤组织状态不佳且容易褐化，影响后续再生体系的构建以及基因功能的验证。

基本培养基是愈伤组织诱导和控制愈伤组织结构状态的关键条件，愈伤组织的生长对无机盐浓度的要求较高，基本培养基中的某些成分亦可起到外源调控因子的作用从而影响愈伤组织的形态结构，含有高盐和高硝酸盐的培养基对愈伤组织的诱导和细胞的培养有利，含有中盐和低盐的培养基对根的形成有利[20-21]。王海波等[22]在研究培养基类型对小麦愈伤组织状态的影响时发现硝态氮会抑制愈伤组织的生长，还原态氮促进愈伤组织的生长。B5、MS、1/2MS 和N6培养基是愈伤组织常用的诱导培养基。王枣子的组织培养一般采用MS 培养基，在试验中发现愈伤组织的状态不佳，且容易褐化。植物生长在物质是愈伤组织增殖培养的关键因素，继代愈伤组织活力较弱的可增大生长素的使用量，愈伤组织活力强的通过加大细胞分裂素的使用量来调节愈伤组织的生长状态。不同质地的愈伤组织可通过生长素与细胞分裂素的种类和浓度配比来调控，增大生长素浓度愈伤组织的质地越疏松[23]。本试验研究了不同的培养基类型对愈伤组织诱导的影响和添加不同浓度配比植物生长物质对王枣子疏松愈伤组织增殖的影响，以期得到生长旺盛、疏松的愈伤组织，为王枣子细胞悬浮培养体系的构建奠定初步基础。

1 材料与方法

1.1 材料

11 月从安徽淮北相山采集当年生王枣子种子，经淮北师范大学生命科学学院薛建平教授鉴定为王枣子Isodon amethystoides（Benth）Cy Wu et Hsuan。种子去壳晒干备用。

1.2 方法

1.2.1 供试无菌苗的获得

挑选黑褐色有花纹的饱满的种子，用200 mg·L-1赤霉素浸泡过夜，流水下冲洗干净，在超净工作台上用75%酒精处理30-60 s，用无菌水冲洗2 次，0.1%升汞溶液处理5-8 min，无菌水冲洗3-5 次，用无菌纸吸干种子表面水分放入MS 培养基中，恒温光照培养箱内培养10 天，转移到恒温光照培养室内培养5 天，选择健壮的生长状态相同的无菌苗作为供试无菌苗。

1.2.2 培养基类型对愈伤组织诱导的影响

采用单因素完全随机试验设计，通过对比确定出最佳的诱导培养基类型。在超净工作台上将供试王枣子无菌苗的幼叶用解剖刀划开小口子，参照段永波[30]等人的王枣子愈伤组织培养条件，将无菌苗的幼叶接入分别添加了6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.0 mg·L-1和NAA 0.5 mg·L-1的B5、1/2MS和MS(添加蔗糖3%、琼脂0.7%，调节pH 5.8-6.0)培养基中，每个试验组6 瓶，外植体数目5-6个/瓶，培养温度为(25±1)℃，培养湿度为70%-80%，25 天后统一计算诱导率。诱导率(%)=长出愈伤数/总接种数×100%。试验重复3次。

1.2.3 王枣子愈伤组织增殖培养试验

1.2.3.1 供试愈伤组织的获得

参照段永波等[30]的王枣子组织培养条件，将王枣子供试无菌苗幼苗叶片接入1.2.2 试验所得添加了NAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1（含有7 g·L-1琼脂和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8-6.0）的最佳基本培养基中，培养温度为(25±1)℃，相对培养湿度为70%-80%，遮光培养25天后得到供试愈伤组织。

1.2.3.2 愈伤组织的增殖培养

采用L9(32)正交试验设计，设置2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)浓度为0.5、1.5、2.5 mg·L-1和KT(激动素)浓度为0.2、0.5、1.0 mg·L-1，共9组试验。将不同质量浓度的这两种植物生长物质分别添加至试验1.2.2 得到的最佳基本培养基中。在超净工作台上选取生长速度快、生长状态佳且状态一致的淡黄色王枣子供试愈伤组织，轻轻用镊子捏碎并接种至含有不同组合浓度的2，4-D、KT 的培养基中，每个试验组6 瓶，外植体数目5-6个/瓶，遮光培养，培养温度为(25±1)℃，相对培养湿度为70%-80%，每隔几天统计生长增殖及褐化情况，28 d后统一取样称量鲜重，并计算增殖倍数。增殖倍数=(28天后称重－初始称重)/初始称重。试验重复3次。

1.3 数据统计和分析

用Excel 2003 进行数据处理，SPSS 17.0 软件进行方差分析、极差分析和Duncan分析。

2 结果与分析

2.1 基本培养基类型对王枣子愈伤组织诱导的影响

在其他培养条件均一致的条件下，三种不同类型的培养基对王枣子愈伤组织的出愈时间、诱导率和生长状态的影响见表1。

由表1 可知，三种不同基本培养基类型对王枣子幼叶愈伤组织出愈时间和诱导率的影响差异显著。王枣子幼叶在不同类型的培养基上均能诱导出愈伤组织。从愈伤组织的启动时间来看，在MS、1/2MS 和B5培养基上的愈伤组织的启动时间呈现逐渐减小的趋势，在MS 培养基上的平均出愈时间最晚，为（7.00±1.00）天；1/2MS 培养基的平均出愈时间次之为（5.33±0.58）天，比MS 培养基的出愈时间提前了23.86%；B5培养基上最先出现幼叶伤口膨大，平均出愈时间最短为（3.67±0.58）天，比MS和1/2MS培养基的平均出愈时间分别提前了47.57%和31.14%。从王枣子幼叶愈伤组织的诱导率来看，在三种不同类型的培养基中诱导率呈现逐渐上升的趋势，以MS 培养基上最小，为（85.56±1.11）%；1/2MS培养基的诱导率增大到（91.48±1.28）%，比MS 培养基增大了6.92%；B5培养基上愈伤的诱导率最大为（97.41±1.70）%，比1/2MS 和MS 培养基分别增大了6.48%和13.85%。从愈伤组织的形态特征来看，愈伤组织的颜色均为健康的淡黄色，其中在B5和1/2MS培养基上愈伤组织的质地较软，MS培养基上愈伤组织的质地较硬且致密程度较大，见图1。从愈伤组织的生长状态来看，从MS、1/2MS 到B5培养基上愈伤组织的生长状况呈现逐渐转好的趋势，B5培养基上愈伤组织的生长状态最佳，1/2MS 培养基上次之，MS 培养基上愈伤组织的生长状态稍差。综合以上分析结果认为，王枣子幼叶愈伤组织的诱导以B5培养基作为基本培养基优于MS、1/2MS培养基。

2.2 植物生长物质的浓度对王枣子愈伤组织增殖培养的影响

植物生长物质的不同浓度配比对王枣子愈伤组织增殖培养的影响见表2。继代培养时培养基中添加不同质量浓度配比的2，4-D 和KT 均能使王枣子愈伤组织出现不同程度的生长。第9 组试验中，即2，4-D浓度为2.5 mg·L-1和KT浓度为1.0 mg·L-1时，王枣子愈伤组织増殖倍数最小为19.78 倍；第2 组试验中2，4-D浓度为1.5 mg·L-1和KT浓度为0.2 mg·L-1时，王枣子愈伤组织増殖倍数最大，达到27.34 倍，比第9 组试验增大了38.22%。数据的直观分析结果显示，增殖倍数中2，4-D 的极差为 6.02，KT 的极差为 1.83，可见 2，4-D在增殖培养中作用大于KT，即2，4-D 与KT 对王枣子愈伤组织增殖倍数影响的主次关系为2，4-D>KT。数据的方差分析结果显示，不同质量浓度的2，4-D 对王枣子愈伤组织的增殖倍数有极显著影响(P<0.01)，KT对王枣子愈伤组织的增殖没有显著影响(P=0.091)。

由表2可知，9组培养基上的愈伤组织生长状态不一且出现了不同程度的褐化，愈伤组织在KT 浓度为0.2 mg·L-1时褐化程度普遍较严重，其中在第1 组试验（2，4-D 浓度为 0.5 mg·L-1和 KT 浓度为 0.2 mg·L-1）中愈伤组织的褐化程度最严重、致密程度较大且生长状态最差；第5 组试验（2，4-D 浓度为 1.5 mg·L-1和KT 浓度为0.5 mg·L-1）中愈伤组织的褐化程度轻、较为疏松且生长状态较好（见图2）。

综合极差分析和方差分析结果，王枣子疏松愈伤组织增殖培养基中选择第5组试验的植物生长物质浓度配比为佳的，即适合王枣子疏松愈伤组织继代的植物生长物质浓度配比为2，4-D 1.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

表1 不同基本培养基类型对愈伤组织诱导的影响

图1 不同类型基本培养基上叶片诱导的愈伤组织状况

表2 不同浓度植物生长物质对王枣子愈伤组织增殖的影响

图2 王枣子愈伤组织增殖培养增殖情况

3 讨论

愈伤组织的状态是植物基因型和生长环境的共同作用的结果，生长环境能在很大程度上影响愈伤组织的质地、颜色和生理状态等[31-32]。愈伤组织的诱导和继代是王枣子组织培养的重要内容，基本培养基中的某些组分和外源添加植物生长物质的种类以及浓度成为影响王枣子愈伤组织状态的重要因素。

在进行植物细胞组织培养时，不同类型的培养基提供的营养、离子浓度、渗透压和细胞生长环境也不同，培养基中各种元素的种类与含量会影响植物材料的培养效果，也是试验成功的必要条件[33]。植物材料的不同品种一般所采用的基本培养基类型都会有所差异[34]，陈英等研究发现[35]，B5培养基在峨眉拟单性木兰的诱导中有较好的诱导效果。本试验中，在其他培养条件都一致的条件下，选用了MS、1/2MS、B5培养基探究对王枣子幼叶愈伤组织诱导的影响，结果发现愈伤组织的诱导率和出愈时间在三种不同类型培养基中有显著差异，B5培养基的诱导效果最好，1/2MS培养基次之，MS 培养基的效果稍差。由此可见，基本培养基成分对王枣子愈伤组织诱导有一定影响，与前人的研究结果相符。大量研究表明，培养基中的某些成分和外源添加的植物生长物质种类以及浓度成都可起到调控作用，改变愈伤组织的质地和生长状态等。

不同浓度配比的植物生长物质对植物疏松愈伤组织增殖培养有重要作用[36]。为了维持愈伤组织的生长状态、保持其不分化又具有分化能力的特性，需要在继代培养过程中调整植物生长物质的种类和使用浓度。本试验为了获得细胞悬浮培养所需的疏松且生长迅速的愈伤组织，探究了不同植物生长物质(2，4-D 和KT)的配比对王枣子愈伤组织继代培养的影响，从试验的结果来看，2，4-D和KT的不同配比对王枣子疏松愈伤组织的增殖培养有很大影响，适当浓度的2，4-D 能促进细胞的生长，在继代培养过程中2，4-D 比KT 的影响效应大，唐丽等[37]研究红翅槭愈伤组织继代的过程中试验中证明了这一点。曾超珍等[38]在研究虎杖疏松愈伤组织诱导条件时发现，2，4-D对虎杖愈伤组织增殖培养时的细胞分裂有显著影响。程佑发等[39]在研究枣愈伤组织诱导和再生植株时发现，2，4-D对增殖培养的作用大于IBA、6-BA、NAA、IAA、ZT、2iP和KT。

本研究表明，不同培养基类型对王枣子愈伤组织的诱导有一定影响，应选择B5培养基作为王枣子愈伤组织诱导的基本培养基；在继代培养过程中，2，4-D对王枣子疏松愈伤组织的增殖效应影响较大。此外，本试验中发现王枣子愈伤组织在增殖培养过程中出现不同程度的褐化状况，可以尝试通过添加适当的抗褐化剂和吸附剂减轻褐化现象，关于减轻增殖过程中褐化方面的研究还需深入研究。