施磷肥对大豆土壤微生物数量及酶活性的影响

廖朝选，钱青青，齐 凯，罗 干，何 季

(1.贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014；2.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025)

大豆在现代社会是不可缺少的作物之一，中国拥有世界上最丰富的大豆资源。大豆不仅是重要的油料作物，还是人类日常生活中植物蛋白的重要来源。[1]此外，大豆还是重要的保健食品和工业原料。[2]自2004年以来，我国大豆总产量持续下降，但进口量却持续增加，严重威胁我国粮油食品安全。[3]目前，我国大豆的种植面积在不断减少，加上生产技术的落后，导致我国大豆产量的单产、总产都不高，进而严重影响豆农的经济效益和种豆热情，生产的恶性循环与国际大豆的竞争失利使我国的大豆生产陷入危机。[4]有研究表明，土壤有效磷的缺乏是制约大豆单产的主要营养因素。[5-6]而长期大量施用磷肥会导致大多数农田中的磷素含量很高，但大多数都是不能被植株直接吸收利用的，而能被作物直接吸收利用供其生长发育的磷素很少，这常被称之为“遗传学缺磷”。[7]不同的立地条件、气候因素和地质背景等导致大豆具有极高的遗传多样性。筛选低磷条件下具有较高适应能力的大豆种质资源将极大地促进大豆种质资源创新和高效生产，也是提高作物磷利用率以及大豆产量的关键所在。土壤性质对于实现大豆的高效、高产、稳产具有重要意义，因此，研究不同品种大豆土壤磷添加与土壤特性之间的关系十分必要。

植物的生长在土壤中不能脱离微生物的作用，尤其是共生微生物和根际微生物。[8]微生物数量及种群结构在一定程度上受土壤环境的影响而变化,它可以反映土壤的生物学环境，能作为土壤肥力的一个指标。[9]土壤酶是土壤组分中最为活跃的有机成分之一，它对土壤环境变化的响应十分敏感[10]，其活性不仅可以反映土壤微生物活性，还可以表征土壤养分的转化与运移能力，是评价土壤肥力和表征生态环境质量优劣的重要参数之一。[11-13]施肥能有效提高土壤微生物的根际效应，增加土壤中微生物数量，并能改变土壤酶的活性。[14]但是长期单施和过量施用化肥也会导致土壤有机质含量降低、土壤微生物性状发生变化。[15-16]而微生物的分泌物和土壤酶能提高土壤磷的有效性，如微生物和酶具有将土壤中有机磷转化成可供植物吸收的无机磷的能力，以增加土壤磷的利用效率。[8, 17-18]豆科植物具有固氮能力，但需要磷素为其提供结瘤营养，为了进一步探究施肥与大豆土壤微生物和酶活性之间的关系，本研究以黔豆8号、9号和10号为对象，通过测定施磷肥大豆土壤和不施磷肥大豆土壤微生物的数量和土壤酶的活性，研究不同品种大豆土壤的微生物数量与酶活性对施磷肥的响应，从而为大豆种植提出适宜的施肥建议。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验区位于贵州省铜仁市石阡县汤山镇，东经108°22′9″～108°22′18″，北纬27°30′2″～27°30′12″，属喀斯特地貌，山地面积占大多数，达70%。该区属于中亚热带季风湿润气候，冬无严寒夏无酷暑，全年平均气温为16 ℃～17 ℃，年降雨量为1050～1150mm。日照充足、暖湿同季、气候温和、无霜期长。试验区在山脚，其土壤类型为黄壤，呈酸性，其基本理化性质见表1。

表1 研究区土壤物理化学性质

1.2 研究方法

1.2.1 试验设计

以石阡县汤山镇的小面积大豆土壤为研究对象。在大田条件下，选择贵州省黔豆8号、9号和10号为试验材料，在研究区进行大田试验。每公顷施入氮(尿素)50kg，钾(草木灰)40kg，氮肥和钾肥作为基肥在种植前施入。试验采取裂区区组设计，磷肥处理为主区：施磷(每公顷35kg)和不施磷肥(CK)；品种处理为副区：黔豆8号、9号和10号；每个处理3次重复，每个小区面积为6m2(2m×3m)，采取穴播方式种植(行距为40cm，株距20cm，每穴2粒)。2018年4月上旬播种，统计田间出苗情况，全生育期内雨养处理，手工清除田间杂草。

1.2.2 样品采集

2018年8月中旬于大豆收获时取土，每个小区取对角线上三点，用无菌小铲子除去表层土，分层取0～20cm、20～40cm土壤样品，充分混匀后用四分法分出约1kg的土样，盛入无菌塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点环境等，将土带回实验室。土壤样品分两部分：测定酶的土样在自然条件下风干，拣去植物残渣和石块，用研钵研磨制备成2mm和0.25mm两个粒级的样品，用自封袋装好写上标签备用；而测微生物的土样取回后立即放在4℃冰箱中保存待测。

1.2.3 测定方法

土壤微生物数量采用稀释涂布平板法测定，采用牛肉膏蛋白胨培养基平板混菌法培养细菌，马丁氏培养基平板混菌法培养真菌，高氏Ⅰ号培养基平板混菌法培养放线菌。利用苯酚钠比色法测定脲酶活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶酶活性，3，5—二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性，磷酸苯二钠比色法测定酸性磷酸酶酶活性。[19]

1.2.4 数据分析方法

采用SPSS 17.0进行统计与分析，用单因素方差分析(One-Way ANOVA)的方法进行方差分析，用最小显著差异法(LSD)进行多重比较。显著性水平设定为α=0.05。采用Excel和Sigmaplot10.0制图。

2 结果

2.1 施磷肥对土壤微生物数量的影响

由表2可知，在0～20cm土层中，细菌数量最多，其次是放线菌，最少为真菌。不施肥条件下，黔豆8号和9号的细菌数量显著高于10号(P<0.05)，黔豆8号、9号和10号的真菌和放线菌数量之间没有显著差异(P>0.05)；施磷肥条件下，3个品种大豆的土壤微生物数量之间同样没有显著差异(P>0.05)。同一个大豆品种，施磷肥与不施磷肥的土壤细菌、真菌、放线菌数量均有显著差异(P<0.05)；与不施磷肥相比，黔豆8号的细菌、放线菌、真菌数量分别增加19.6%、30.26%、33.2%；黔豆9号分别增加23.13%、33.84%、37.77%；黔豆10号分别增加37.28%、44.34%、56.97%，黔豆10号的微生物数量增加最明显。

表2 磷肥施用对0-20cm土层土壤微生物数量的影响

由表3可知，在20～40cm土层中，细菌数量最多，其次是放线菌，最少为真菌。不施肥条件下，黔豆9号的真菌数量显著高于8号和10号(P<0.05)，3个品种大豆土壤的细菌和放线菌数量之间没有显著差异(P>0.05)；施磷肥条件下，黔豆9号和10号的细菌数量显著高于8号(P<0.05)，黔豆9号的真菌数量显著高于8号(P<0.05)，3个品种大豆土壤的放线菌数量之间没有显著差异(P>0.05)。同一个大豆品种，施磷肥与不施磷肥处理土壤细菌、真菌、放线菌数量均有显著差异(P<0.05)；与不施磷肥相比，黔豆8号的细菌、放线菌、真菌数量分别增加28.06%、54.59%、52.97%；黔豆9号分别增加33.50%、45.55%、38.64%；黔豆10号分别增加47.64%、61.6%、75.22%，黔豆10号的微生物数量增加最明显。

表3 磷肥施用对20-40cm土层土壤微生物数量的影响

0～20cm层土壤中细菌、放线菌、真菌数量明显高于20～40cm层。不施磷肥土壤中黔豆8号0～20cm土层中细菌、放线菌、真菌数量分别是20～40cm层的1.46倍、1.44倍、1.39倍；黔豆9号分别为1.34倍、1.37倍、1.14倍；黔豆10号分别为1.08倍、1.34倍、1.46倍。施磷肥土壤中黔豆8号0～20cm土层中细菌、放线菌、真菌数量分别是20-40cm层的1.36倍、1.21倍、1.21倍；黔豆9号分别为1.24倍、1.26倍、1.14倍；黔豆10号分别为1.15倍、1.20倍、1.31倍。

2.2 施磷肥对土壤酶活性的影响

2.2.1 施磷肥对大豆土壤酸性磷酸酶活性的影响

土壤磷酸酶是一种常见的水解酶，广泛分布于生物界，由于土壤酸碱性影响其活性，可将其分为酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶，本试验测定土壤为酸性土，酸性磷酸酶活性最强，因此最终选择测定酸性磷酸酶活性，磷酸酶活性以24h后每克土壤中的酚毫克数表示。由图1可知，各处理下，0～20cm土层的酸性磷酸酶活性均高于20～40cm；在0～20cm土层中，不同品种大豆土壤的酸性磷酸酶活性在施磷肥后均有显著降低(P<0.05)，黔豆8号、9号和10号不施磷肥土壤中的酸性磷酸酶活性比施磷肥条件下分别高62.17%、32.47%和52.97%；20～40cm土层中，黔豆8号、9号土壤的酸性磷酸酶活性在施磷和不施磷间没有显著差异(P>0.05)，黔豆10号不施磷条件下的酸性磷酸酶活性显著高于施磷条件下(P<0.05)，高39.42%。

注：小写字母不同表示0～20cm土层在0.05水平上差异显著；大写字母不同表示20～40cm土层在0.05水平上差异显著。图1 磷肥施用对大豆土壤酸性磷酸酶活性的影响

2.2.2 施磷肥对大豆土壤脲酶活性的影响

土壤脲酶是研究较为广泛深入的一种酶，是尿素胺基水解酶类的统称，广泛存在于土壤中。脲酶作用单一，只能水解尿素。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、全氮、有机物质含量及速效磷含量呈正相关。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。本试验土壤脲酶活性以24h后每克土壤中NH3～N的毫克数表示。由图2可知，各处理下，0～20cm土层的脲酶活性均高于20～40cm。0～20cm土层中，黔豆8号和黔豆9号不施磷肥土壤的脲酶活性显著高于施磷肥土壤(P<0.05)，分别高30.09%和25.18%。黔豆10号不施磷肥与施磷肥土壤的脲酶活性之间没有显著差异(P>0.05)。20～40cm土层中，黔豆8号、黔豆9号和黔豆10号不施磷肥与施磷肥土壤的脲酶活性之间均没有显著差异(P>0.05)。

注：小写字母不同表示0～20cm土层在0.05水平上差异显著；大写字母不同表示20～40cm土层在0.05水平上差异显著。图2 磷肥施用对大豆土壤脲酶活性的影响

2.2.3 施磷肥对大豆土壤过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶的活性可以表征土壤肥力状况和生物学活性。根际土壤的过氧化氢酶活性远较根际外土壤高。有机质含量高的土壤，过氧化氢酶的活性较强。本试验过氧化氢酶酶活性以20min后的每克土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。由图3可知，处理后，0～20cm土层的过氧化氢酶活性高于20～40cm层。在0～20cm土层中，不同品种大豆土壤的过氧化氢酶活性在施磷肥后均有升高，黔豆8号、9号和10号分别升高15.84%、22.31%和33.29%；其中，黔豆8号和黔豆9号施磷肥土壤的过氧化氢酶活性与不施磷肥土壤之间没有显著差异(P>0.05)，黔豆10号施磷肥土壤的过氧化氢酶活性与施磷肥土壤之间有显著差异(P<0.05)。在20～40cm土层中，黔豆8号、黔豆9号和黔豆10号不施磷肥与施磷肥土壤的过氧化氢酶活性之间均没有显著差异(P>0.05)。

注：小写字母不同表示0～20cm土层在0.05水平上差异显著；大写字母不同表示20～40cm土层在0.05水平上差异显著。图3 磷肥施用对大豆土壤过氧化氢酶活性的影响

2.2.4 施磷肥对大豆土壤蔗糖酶活性的影响

土壤蔗糖酶与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，其与土壤有机质的相关性最大。它能够表征土壤生物学活性强度，也可以作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的一个指标。本试验中蔗糖酶活性以24h后每克土壤中葡萄糖的毫克质量表示。由图4可知，各处理下，0～20cm土层的过氧化氢酶活性高于20～40cm层。在0～20cm土层中，不同品种大豆土壤的蔗糖酶活性之间差异均达到显著水平(P<0.05)；其中，施磷肥黔豆8号、黔豆9号黔豆10号的土壤蔗糖酶活性分别比不施磷肥的同品种的土壤蔗糖酶活性高34%、57%、93%。在20～40cm土层中，3个品种大豆土壤施磷肥条件下的蔗糖酶活性均高于不施磷肥土壤，且均达到显著水平(P<0.05)。

注：小写字母不同表示0～20cm土层在0.05水平上差异显著；大写字母不同表示20～40cm土层在0.05水平上差异显著。图4 磷肥施用对大豆土壤蔗糖酶活性的影响

2.3 土壤酶活性与微生物数量的相关性分析

从表4可知，在0～20cm土层中，细菌和放线菌数量与过氧化氢酶和蔗糖酶活性呈显著的正相关关系(P<0.05)，与酸性磷酸酶活性呈显著的负相关关系(P<0.05)，与脲酶活性相关性较小。真菌数量与过氧化氢酶活性呈显著的正相关关系(P<0.05)，与酸性磷酸酶活性呈显著的负相关关系(P<0.05)，与脲酶及蔗糖酶活性相关性较小。从表5可知，在20～40cm土层中，土壤中的细菌、真菌、放线菌数量与酸性磷酸酶及蔗糖酶活性显著相关(P<0.05)，其中与酸性磷酸酶呈显著正相关关系(P<0.05)，与蔗糖酶活性呈显著负相关关系(P<0.05)。

表4 0～20cm层微生物数量与土壤酶活性的相关性

表5 20～40cm层微生物数量与土壤酶活性的相关性

3 结论与讨论

3.1 讨论

施肥对土壤中微生物数量和种类有不同程度影响，而种植不同种类作物其土壤微生物的数量对施肥的响应也不同。[20-22]本研究以贵州大豆育成品种黔豆8、9和10号为对象，通过对施加磷肥的成熟期大豆土壤与不施加磷肥的成熟期大豆土壤进行微生物数量的测定，发现施加磷肥在一定程度上能增加大豆土壤细菌、真菌、放线菌的数量，这主要是由于施入的磷肥可以促进大豆地上部分的生长，增加了外源碳的输入，以此增加了土壤微生物数量和活性。[23]此外，土壤中有效磷的增加可以促使大豆根瘤的形成，有利于大豆根系的生长发育，增加大豆根系分泌物，进而改变大豆根际环境，使大豆根际形成适宜微生物生长发育的环境。而少量施入磷肥有助于土壤团聚体的形成，改良土壤结构，为微生物生长繁殖提供了良好的条件[24-25]，在0～20cm土层，增加数量最多的为真菌数量，是因为磷肥的施入增加土壤酸性，形成适宜真菌生长发育的酸性环境，从而使土壤中真菌数量增加明显。研究结果还表明，黔豆10号土壤的微生物数量对施磷肥的响应最明显，其中0～20cm土层黔豆10号细菌、放线菌、真菌数量分别增加37.28%、44.34%、56.97%，20～40cm土层黔豆10号细菌、放线菌、真菌数量分别增加47.64%、61.6%、75.22%，说明在低磷条件下，黔豆10号具有更好的适应性和生产潜力。

土壤酶是土壤微生物活性的重要组成部分，是催化一系列生理生化反应、促进物质循环和能量流动的重要物质，其活性与植物生长密切相关。[26-28]有研究表明，施肥能够显著影响土壤中酶活性，磷添加能显著增加土壤过氧化氢酶活性，并能不同程度的抑制根际与非根际土壤脲酶活性。[29]本研究结果表明，在施加磷肥时，大豆成熟期土壤中蔗糖酶活性增加，这主要与种植豆科植物有关。因为蔗糖酶活性受土壤氮含量影响，大豆具有固氮作用，施肥后根系的固氮能力会增加，进而增加土壤中氮含量以促进蔗糖酶活性增加。此外，有研究也表明细菌数量与蔗糖酶活性有明显的正相关关系，本研究中细菌数量增加也说明了这一点。本研究中，施磷肥使黔豆10号土壤的蔗糖酶和过氧化氢酶活性升高明显，分别升高93%和33%，说明在低磷条件下，黔豆10号能通过调节土壤微生物数量与酶活性，更好地适应土壤环境的变化。在0～20cm土层中，不施磷肥土壤的酸性磷酸酶活性均高于施磷肥土壤酸性磷酸酶活性，这与Wang等[30]提出的单施磷肥对酶活性有明显抑制作用这一结论基本一致，因为施入磷肥后，土壤中游离的磷酸含量升高太多，导致磷酸酶活性降低，或者与土壤中有效钾含量低有关，因为土壤中有效钾含量过低时，增加磷素会降低土壤磷酸酶的活性。[31]但本研究中，施磷肥后酸性磷酸酶活性降低的机理仍尚不清楚，具体原因有待进一步分析。20～40cm土层中，同一大豆品种的酸性磷酸酶活性在不同处理之间大多没有显著差异，可能是因为施入的磷肥并没有对下层土壤产生作用，也有可能是因为大豆根系短，没有延伸到该层，缺少根际作用，具体原因有待进一步分析。本研究中，施加磷肥在一定程度上会降低土壤脲酶的活性，这与王朋超等[29]和贺根和等[32]的研究结果基本一致。脲酶活性降低可显著减少土壤中养分流失，而在农业生产上，常常需要使用脲酶抑制剂来抑制脲酶活性以降低氮肥的损失，研究结果表明，可在一定范围内向土壤施加磷肥来达到降低脲酶活性的目的。

研究中测定的土壤微生物数量与酶活性之间是存在一定的相关性，证实了大部分土壤酶来自土壤微生物的说法，这可能是土壤形成有利于微生物生长发育的环境，加上表层土壤水热及通气情况较好，营养充分，使土壤微生物生长旺盛、代谢活跃，从而增加相应酶的活性。研究通过分析施磷肥对大豆成熟期土壤微生物数量及酶活性的影响，揭示土壤磷与土壤微生物、酶活性之间的相互关系，结果表明施磷肥能显著提高土壤中微生物的数量，增强过氧化氢酶和蔗糖酶的活性，减少土壤中养分流失，在一定程度上提高了土壤肥力，[33]其中，黔豆10号土壤微生物数量和酶活性对施用磷肥响应最明显，研究可为大豆合理施肥、优异基因挖掘以及低磷条件下高产大豆新品种的选育提供依据。

3.2 结论

不同处理不同土层的微生物数量均表现为细菌>放线菌>真菌；0～20cm、20～40cm土层中施磷肥均能显著增加土壤细菌、真菌、放线菌的数量；细菌、真菌、放线菌数量均随土层的深入而减少。施磷肥能增加大豆成熟期土壤的蔗糖酶活性，降低土壤酸性磷酸酶和土壤脲酶的活性，对大部分土壤的过氧化氢酶的影响不明显；所测定的土壤酶的活性均随土层的深入而降低。

与不施磷肥处理相比，施磷肥使黔豆10号微生物数量增加最多，其中0～20cm土层黔豆10号细菌、放线菌、真菌数量分别增加37.28%、44.34%、56.97%；20～40cm土层黔豆10号细菌、放线菌、真菌数量分别增加47.64%、61.6%、75.22%。施磷肥使黔豆8号土壤的脲酶与酸性磷酸酶活性降低最明显，分别降低23%和38%；施磷肥使黔豆10号土壤的蔗糖酶和过氧化氢酶活性升高明显，分别升高93%和33%。

在0～20cm土层中，土壤中的细菌、真菌、放线菌数量与土壤过氧化氢酶、酸性磷酸酶活性显著相关(P<0.05)，细菌和放线菌数量与蔗糖酶活性显著相关(P<0.05)。20～40cm土层中，土壤中的细菌、真菌、放线菌数量与酸性磷酸酶及蔗糖酶活性显著相关，其中与酸性磷酸酶呈显著正相关，与蔗糖酶活性呈显著负相关。