休眠卵孵化对策与食物浓度对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)两品系干雌体种群增长的影响

邢康南,牛翠娟

生物多样性与生态工程教育部重点实验室,北京师范大学生命科学学院, 北京 100875

单巢纲轮虫生活史为典型的世代交替,休眠卵的形成是其生活史中非常重要的一部分,轮虫依靠休眠卵来适应不良环境的变化,对延续种群、保留基因有重要意义。因此,与休眠相联系的有性生殖也被看作是对不良环境的适应[1-3]。一个基因要被保留下来,必须在种群中传递下去,而环境中的不利因素对这一过程有阻碍作用。由于休眠期的存在,带有基因变异的休眠卵的形成和这些具有基因变异后代的出生在时间上分隔开来,分隔时间或长或短。轮虫休眠卵库就像“种子贮存库”一样,当环境恢复到适宜轮虫生存时, 它们可以在短时间内孵化出来并依靠孤雌生殖迅速繁衍扩大种群,有利于种群避开不利的生态因子,使该物种的基因在栖息地中保留下来,而不至于灭绝。此外,休眠卵耐干旱的特性是轮虫在全球范围内广泛分布的原因,因为高耐旱能力有助于休眠卵的散布,例如借助风力或鸟类、昆虫等动物的衔食而散布到更广泛的范围以致全球范围内,这样可使轮虫从不适宜生存的环境中解放出来,尽快在适宜生存的环境孵化、增殖[4-5]。

对单巢纲轮虫休眠卵的早期研究主要集中于休眠卵形成、孵化过程及其影响因素等方面,随着研究的逐渐深入,休眠卵的孵化时间引起了研究者的关注[6- 8]。有性生殖产生的休眠卵会沉入自然水体底泥中的休眠卵库进行休眠,休眠时长在轮虫种间和种内均有差异[8]。以往通常认为,休眠卵会休眠至下一个生长季,乃至数年之后才萌发,相对于轮虫仅能持续数天至几周的寿命而言,休眠时间较长[6,9- 11]。然而,一些实验室研究发现部分休眠卵在产生后的几天之内便开始孵化,称为早孵化现象(early hatching)[11- 15]。虽然目前少有确凿证据显示野外环境下也存在休眠卵的早孵化现象,但是Gilbert[16]预测这个现象在自然环境中可能十分普遍,并且具有重要意义。原因有两点,一是为使种群获得尽可能大的短期适合度,即使已经开始进行有性生殖,种群也应当保持优良的孤雌生殖,而休眠卵的早孵化恰好对此有利；二是在生长季开始了一段时日之后,种群的基因多样性在自然选择作用下减小,此时休眠卵的早孵化能为种群带来新的遗传变异,其中有可能包含更适应此时环境的基因型[16]。此外,有研究者提出轮虫休眠卵的孵化时间是一个具有“两头下注对策”的生活史特征[10,17],即轮虫的单克隆种群能通过产生具有不同孵化对策的休眠卵来分摊风险,有研究表明孵化对策多样性与该克隆群所处环境的不可预测性呈出明显的正相关[18-20]。

目前,关于休眠卵孵化对策的研究主要集中于对孵化对策的影响因素上[7-8,10],尚不清楚不同轮虫或同种轮虫的不同品系在孵化对策上是否存在偏好；孵化对策又如何影响其干雌体后代克隆群的增长与繁殖[11],对于这些问题的定量研究有助于了解早孵化现象对轮虫种群适合度的影响。

本研究拟采用萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)的两个品系H1、D1为实验动物模型,通过比较观测两种孵化对策下的干雌体单克隆种群的增长及有性生殖率(混交率)的差异,来探究孵化对策对后代种群增长的影响。H1、D1两品系均采集自北京西海(116°38′87.28″E, 39°94′94.31″N),但是在自然水体中的生长时间不同：H1的生长季为8—9月,是窄温度生态位品系；而D1的生长季为5—10月,是宽温度生态位品系[21]。两品系来源地4—11月部分环境指标数据见表1。本研究可为深入了解轮虫“休眠”的功能作用及其生活史的适应性进化提供基础数据,并可为水产养殖中重要饵料生物轮虫的培养提供一定的理论参考。

表1 北京西海4—11月水体部分环境因子观测数值

1 材料与方法

1.1 两种孵化对策的休眠卵和食物的制备

本研究的两个萼花臂尾轮虫品系均为本实验室自野外采集,在实验室内保种培养的样本。两种孵化对策的休眠卵制备方法为：将从克隆群中收集的休眠卵直接孵化,数天之内萌发的可认定为早孵化休眠卵；将收集的休眠卵置于4℃下避光保存40 d后再放到相同孵化条件下萌发,模拟经历了较长休眠期的晚孵化休眠卵。

轮虫的食物为蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)(购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库),经无菌接种后,扩大培养于SE培养液(根据中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的配方进行配置)中,恒温光照培养(25℃,3000 lx,L∶D=24∶0)。选取指数增长期的藻液,在4℃,7000 r/min离心6 min,收集的浓缩藻液,使用分光光度计测定其原始浓度,4℃储存备用。

1.2 实验处理过程

取各品系的休眠卵,两种孵化对策组各约80枚,分别置于盛有30 mL COMBO培养液的烧杯中孵化,孵化及后续的种群培养条件均为培养温度20℃、光照强度3000 lx、光周期L∶D=16∶8。挑选健康的、出生2h以内的幼体于6孔板中进行单克隆培养,每孔培养体积为5 mL,培养起始密度为0.2 ind/mL。每个品系各设置4个实验组：晚孵化-高食物浓度(LH-HF(2×106个细胞/mL)),晚孵化-低食物浓度(LH-LF(5×105个细胞/mL)),早孵化-高食物浓度(EH-HF),早孵化-低食物浓度(EH-LF),每个实验组10个重复。每12h换一次培养液并观察一次,统计每个孔中非混交雌体(amictic female,AF)数量、混交雌体(mictic female,MF)数量和个体总数(N),计算混交率MR “MR=MF/N”。统计时,带有非混交卵的成熟个体计入非混交雌体数量,带有雄卵或休眠卵的成熟个体计入混交雌体数量,所有个体均计入总数。

1.3 数据分析

对各实验组种群增长曲线进行Logistic方程拟合,得出方程中参数的估计值。拟合使用的公式为：N=K/(1+ea-rt),其中N为种群数量观测值,待定参数K为环境容纳量,r为内禀增长率,a为积分常数。对混交率、内禀增长率数据进行反正弦转换。用S-W正态分布检验和Levene方差齐性检验检测数据的正态分布和方差齐性,若符合,则对各品系的内禀增长率、最大种群数量、开始进行有性生殖时的种群密度和混交率进行双因素方差分析,进一步用LSD进行两两比较；若数据经一定转换后仍不满足进行方差分析的要求,则对数据进行非参数检验。实验统计结果以平均值±标准误(Mean ± SE)表示,差异显著性水平设定为0.05,全部统计分析采用SPSS 20.0软件,并采用Origin 9.0作图。

2 结果

2.1 不同处理组种群数量随时间的变化

2.1.1种群数量增长曲线

两品系不同处理组的种群增长曲线如图1所示。

图1 不同实验处理组的种群数量增长曲线(数据表示为：Mean±SE)Fig.1 Population growth curve of different experimental groups( Data are shown as Mean±SE)D1：宽温度生态位品系；H1：窄温度生态位品系；LH-HF：晚孵化-高食物浓度; LH-LF：晚孵化-低食物浓度; EH-HF：早孵化-高食物浓度; EH-LF：早孵化-低食物浓度

2.1.2Logistic方程拟合

对各实验组种群增长曲线进行了Logistic方程拟合,获得K、r的估计值和拟合优度R2,如表2所示。除H1品系的低食物浓度下两实验组拟合优度较低外,其余各组均获得较好地拟合效果。

表2 Logistic方程拟合结果

2.1.3内禀增长率

要实现这些目标、路经和模式，任务比较艰巨，其核心人物主要有内部资源管理、内容生产管理、渠道管理、用户管理和运营绩效分析。

对各组内禀增长率数据进行了反正弦转换后,D1仍不符合进行参数检验的要求,因此进行了曼-惠特尼 U 检验,发现孵化对策对D1品系的种群内禀增长率没有显著影响,食物浓度对种群内禀增长率有显著影响,高食物浓度更有利于种群增长,如图2；对H1各组数据进行双因素方差分析,发现孵化对策和食物浓度两因素对H1品系的内禀增长率的综合影响是显著的(P<0.001),并且两因素之间存在交互作用(P<0.001),孵化对策对H1品系的内禀增长率影响不显著(P=0.235),食物浓度对H1品系的内禀增长率影响显著(P<0.001),进一步将四组数据在单因素下用LSD进行两两比较,统计结果如图2。

图2 各处理组内禀增长率的比较(数据表示为：Mean±SE)Fig.2 The intrinsic growth rate of each treatment( Data are shown as Mean±SE)无相同上标字母表示具有统计学显著差异P<0.05

2.1.4最大种群数量

为使数据满足方差齐性,符合进行双因素方差分析的要求,对最大种群数量数据进行了平方根转换。

如表3所示,孵化对策和食物浓度两因素对D1品系的最大种群数量具有显著的综合影响(P=0.002),而两者之间不存在交互作用(P=0.911),两个因素单独对最大种群数量起作用。其中,孵化对策对D1品系的最大种群数量影响显著(P=0.001), 食物浓度对D1品系的最大种群数量也有显著影响(P=0.004,图3)。

表3 孵化对策与食物浓度对品系D1最大种群数量影响的双因素方差分析结果

孵化对策和食物浓度两因素对品系H1的最大种群数量具有显著的综合影响(P<0.001,表4),且两者之间存在交互作用(P<0.001)。孵化对策对H1品系的最大种群数量影响显著(P<0.001),食物浓度对H1品系的最大种群数量影响也显著(P<0.001,图3)。

表4 孵化对策与食物浓度对品系H1最大种群数量影响的双因素方差分析结果

图3 各处理组最大种群数量的比较(数据表示为：Mean±SE)Fig.3 The maximum population size of each treatment (Data are shown as Mean±SE)无相同上标字母表示具有统计学显著差异P < 0.05

2.2 有性生殖

2.2.1种群混交率随时间变化曲线

图4 各处理组混交率随时间的变化曲线(数据表示为：Mean±SE)Fig.4 Mixis ratio curve of each treatment (Data are shown as Mean±SE)

2.2.2各实验组种群开始进行有性生殖时的种群密度

对各组数据进行算数平方根转换后,“低食物浓度”各组数据仍不符合进行双因素方差分析的要求,因此仅探究了高食物浓度下“孵化对策”这一因素对种群开始进行有性生殖时的密度有何影响。对D1数据进行了单因素方差分析(P=0.041),对H1数据进行了曼-惠特尼U检验(P=0.022),结果如图5所示。

图5 不同处理组种群开始进行有性生殖时的种群密度比较(数据表示为：Mean±SE)Fig.5 Comparison of the population density at the beginning of sexual reproduction in different treatment groups(Data are shown as Mean±SE)无相同上标字母表示具有统计学显著差异P<0.05

2.2.3各实验组种群在最高种群密度下的混交率

对各组混交率数据进行算数平方根转换后,“低食物浓度”数据仍不符合进行双因素方差分析的要求,因此仍然仅探究高食物浓度下“孵化对策”这一因素对种群在最高种群密度下的混交率有何影响。对D1、H1数据进行了单因素方差分析,“孵化对策”对D1种群在最高种群密度下的混交率影响不显著(P=0.855),对H1种群在最高种群密度下的混交率有显著影响(P=0.044,图6)。

图6 不同处理种群在最高种群密度下的混交率(数据表示为：Mean±SE)Fig.6 Mixis ratio at peak population density of different experimental groups(Data are shown as Mean±SE)无相同上标字母表示具有统计学显著差异P<0.05

3 讨论

本研究主要观测了萼花臂尾轮虫(B.calyciflorus)的两个品系H1、D1在不同休眠卵孵化对策和不同食物浓度下干雌体形成的单克隆种群增长的差异。本研究发现,休眠卵孵化对策确实对其干雌体克隆种群的增长产生了影响,但具体影响的结果与各品系在自然环境中的生长季的时间有关。同一品系中,内禀增长率和最大种群数量的分析结果表明孵化对策会对种群最终能占领的环境资源多少产生影响,早孵化更有利于生长季时间较长的D1品系的种群增长,晚孵化更有利于生长季时间较短的H1品系的种群增长。

在长期自然选择压力下,不同环境、不同品系的轮虫在与休眠相关的性状(如休眠期存活率、休眠时长和孵化率等)上会呈现出不同的特点[22-23]。休眠期的长短可能受诸多因素的影响[17-18,22],不同孵化对策所占的比例与萌发后种群增长的表现也会相应受到影响。有研究表明,在底泥环境安全的前提下,水体环境不适宜种群生长的时间越长,休眠卵的休眠期也越长[17]。也就是说,环境适宜的生长季越短,种群越倾向于选择较长的休眠期,较晚孵化的休眠卵形成的种群能够获得更高的种群适合度,本研究的结果支持这一发现。

本研究使用的D1和H1为不同温度生态位的萼花臂尾轮虫品系,一年之中适宜宽温度生态位的品系(D1)生长的时间较长,该品系中早孵化的休眠卵在萌发时很可能仍处于环境适宜的生长季内,因此后代种群能够以低混交率快速扩增,在适宜生境下参与竞争。而水体中窄温度生态位品系(H1)生长的时间较短,若过早萌发则可能面临着生长季的结束,采取晚孵化对策才是一个相对保险的选择。另外,影响H1品系的最大种群数量的两个因素(孵化对策和食物浓度)之间存在交互作用,以及Logistic方程拟合的结果(表2)都说明, H1品系对食物浓度的要求较高,当食物缺乏时,食物会超越孵化对策成为影响种群增长的主要因素。H1品系的生长季在夏末秋初,早孵化的个体可能面临已存在的高种群密度个体对食物的竞争和秋季食物生产将随光照和温度下降而降低的双重压力,因而晚孵化更有利。

在一个生长季中,产生足够多的休眠卵可在一定程度上保证种群的长期适合度[24],但进行有性生殖对种群在当下生长季的短期适合度又有明显代价[25,26],种群需要在二者之间进行权衡[27]。种群开始进行有性生殖时的种群密度可以反映出在增长早期对密度信号响应的灵敏性,再结合种群密度较高(达到环境容纳量)时的有性生殖率,可以反映出种群在不同时期通过有性生殖产生休眠卵的倾向性。本研究中,在种群增长的早期,D1品系早孵化的种群比晚孵化的更能经受较高的种群密度,先以较低的有性生殖率迅速扩大种群(图5),优先保证种群在当下生长季的短期适合度,而不急于产生休眠卵保种,这可能和D1品系生长季较长有关。H1品系恰恰与D1相反,早孵化的种群比晚孵化的种群更倾向于尽早产生休眠卵(图5)以应对接下来可能面临的环境胁迫,优先保证种群的长期适合度,对种群增长造成的代价由增长后期相对较低(图6,相对于晚孵化休眠卵后代种群)的混交率来弥补。

总体上,本研究有助于我们了解休眠卵在孵化时间上的两头下注对策与种群自身特性、种群的原始生境之间存在的联系,很可能是轮虫种群对生境时间变异的适应性表现,也使我们能够进一步了解休眠的功能作用,并可以为水产养殖中合理利用和培养饵料生物提供参考。即便是在同一轮虫品系中,甚至是同一克隆群中,也存在着休眠卵孵化对策的差异[15,19],但原因以及不同孵化对策如何影响后代种群动态还需要更多的定量研究。