类风湿关节炎患者淋巴B细胞表达与疾病进展的关系研究

史向辉 严婷婷 沈 洁 叶 俏

类风湿关节炎（RA）的发病机制尚不明确[1]。研究显示，在疾病进展中，调节性T 细胞发挥重要作用，在免疫反应过程中，调节性B 细胞（Breg）具有重要作用，CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞的表达率与类风湿性疾病患者的活动度呈现显著相关性，CD20+B 细胞、CD5+B 细胞在机体的免疫调节以及免疫耐受中发挥重要作用[2-3]。通过对CD19+CD24hi-CD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞表达率的分析，对于临床治疗方向的调整具有重要价值[4]。本研究探讨RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞的表达及其与疾病进展的关系，报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2016 年1 月—2019 年4 月浙江省嘉兴市第二医院诊断的RA 患者120 例为观察组，其中男66 例，女54 例，年龄55～65 岁，病程（37.26±11.26）个月；依据美国风湿病学会确定的关节功能分类标准[5]，疾病严重程度分级：Ⅰ级患者67例，Ⅱ级患者53 例。另选取同期健康体检者120 名为对照组，所有研究对象均签署知情同意书，并经医院伦理委员会审核通过，符合《赫尔辛基宣言》伦理要求。

1.2 观察组纳入标准 （1）所有患者均符合美国风湿学会（ACR）[5]RA 诊断标准；（2）近3 个月内未使用糖皮质激素。

1.3 排除标准 （1）合并其他慢性疾病患者；（2）严重心脏、肝脏、肾脏疾病患者；（3）传染性疾病患者；（4）孕妇或哺乳期患者。

2 研究方法

2.1 淋巴细胞的分离 所有研究对象空腹采集静脉血4mL 置于Na2-EDTA 抗凝管中，将3mL Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液与血液样本充分混匀后，在4℃环境下对以上样本进行离心，2000r/min 离心20min 后，样本分为3 层面，上层和中层之间有白雾状的带状平面，为单核细胞以及淋巴细胞。使用移液管抽取以上云雾层，置于另外一个洁净离心管中，使用5 倍以上的hank 液体进行洗涤，混匀，在4℃环境下对以上样本进行离心，1500r/min，离心半径为20cm，离心15min 后，弃去上清液再次洗涤，再次弃去上清液，加入10%的小牛血清，重悬细胞，在4℃环境下进行保存。

2.2 CD19+CD24hiCD38hi Breg 细 胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞检测 使用流式细胞仪（贝克曼CytoFLEX 仪器，hank 液由上海罗氏提供）对上述样本CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞进行检测。分别对观察组以及对照组研究对象CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较。分析患者的严重程度与CD19+CD24hiCD38hi Breg 细 胞、CD20+B 细 胞、CD5+B 细胞水平的相关性。

2.3 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（） 表示，采用独立样本t 检验，计数资料采用χ2检验。相关性分析采用Spearman 分析，以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 两组研究对象一般资料比较 两组研究对象性别、年龄、体质指数比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组研究对象基线资料比较

3.2 两组研究对象CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较 观察组患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞比例显著低于对照组，CD5+B 细胞比例显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组研究对象CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较（%，）

表2 两组研究对象CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较（%，）

注：观察组为类风湿关节炎患者；对照组为健康体检者

3.3 不同严重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较 Ⅰ级RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B细胞比例显著高于Ⅱ级患者，CD5+B 细胞比例显著低于Ⅱ级患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同严重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较（%，）

表3 不同严重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞水平比较（%，）

注：RA 为类风湿关节炎

3.4 相关性分析 RA 患者的疾病严重程度分级与CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞（r=-0.542，P=0.000）、CD20+B 细胞的（r=-0.459，P=0.000）比例呈负相关，与CD5+B 细胞（r=-0.380，P=0.000）比例现正相关。

4 讨论

RA 是多以对称性以及多关节慢性炎症反应为主的全身性免疫疾病[6]，发病机制尚不明确。目前认为，RA 发病主要与机体免疫活性细胞及抗原提呈细胞的异常性活动相关[7]。在对免疫调节机制的分析中，B 淋巴细胞主要通过对白介素10 以及肿瘤坏死因子的抑制性表达，进而对机体免疫平衡以及免疫耐受进行调节[8]。对病程在5 年以下RA 患者的研究显示，通过激素治疗，患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞水平显著升高，且与疾病活动度以及抗环胍氨酸抗体呈现负相关[9]。有研究指出，CD19+CD24 hiCD38hi Breg 细胞是重要的白介素10 前体细胞[10]；吴桂英和李鸿斌[11]研究显示，健康组CD19+CD24hi CD38hi Breg 细胞水平显著高于RA 组。本研究结果显示，观察组CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞比例显著低于对照组（P＜0.05），与上述研究一致。

本研究显示，观察组患者CD20+B 细胞比例显著低于对照组，且随着患者疾病进展，CD20+B 细胞水平显著下降（P＜0.05）。CD20 是B 细胞的特异性抗原，外周血中CD20 表达水平在一定程度上反映了B细胞的水平，当B 细胞分化为浆细胞后，患者B 细胞的CD20 表达基本消失，在CD20 消失过程中，大量的炎性介质分泌，造成临床症状的产生[12]。同时，CD20还可以在一定程度上通过跨膜钙离子通道对B 细胞信号的转导进行活化，进而对机体免疫功能进行调节[13]。王鑫[14]研究显示，CD20+B 细胞水平的下降以及凋亡，参与了RA 患者的疾病进展，与本研究相互印证。本研究显示，观察组患者CD5+B 细胞比例显著高于对照组，Ⅰ级RA 患者的CD5+B 细胞比例显著低于Ⅱ级患者（P＜0.05）。艾汐汐[15]研究显示，自身免疫性疾病患者的CD5+B 细胞比例显著升高，与本研究一致。认为可通过患者淋巴细胞水平对其免疫状态进行分析，对患者疾病进展进行预测。本研究相关性分析显示，RA 患者的疾病严重程度分级与CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞（r=-0.542）、CD20+B 细胞的（r=-0.459）比例呈现负相关，与CD5+B 细胞（r=-0.380）比例呈现正相关。

综上所述，CD19+CD24hiCD38hi Breg 细胞、CD20+B 细胞、CD5+B 细胞表达情况与类风湿性关节炎患者及其基本分级相关性显著，可作为患者疾病进展的预测指标。