结核分枝杆菌耐药基因芯片检测在复治肺结核患者中的应用价值

施伎蝉 何贵清 宁洪叶 吴联朋 吴正兴 刘赛朵 叶新春 潘宁 蒋贤高

近年来，流动人口的增加、诊治的延误和不规范治疗、患者依从性低等原因导致耐药菌株的增加，造成耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行[1]。2017年世界卫生组织估算我国2016年新发病例89.5万，耐多药/单耐利福平（multidrug-resistant or rifampicin-resistant，MDR/RR）患者 5.8 万[2]，而复治肺结核（re-treatment tuberculosis）中 MDR/RR-TB患者比例达到24%，远高于初治肺结核（primary tuberculosis，TB）中MDR/RR-TB7.1%的比例，且复治肺结核治疗成功后也有部分再次复发[3]。复治患者药物暴露的时间越长，药物治疗的敏感性会越低[4]，并发其他疾病日益增多[5]，多种因素的影响导致复治肺结核的治愈率仅有60%左右[6]。因此快速检测复治肺结核患者的耐药性、及时准确提供有效的治疗，对结核病疫情的控制均至关重要。本研究以BACTEC MGIT 960耐药性检测结果为金指标，将161例复治肺结核患者感染菌株分别进行结核分枝杆菌（MTB）耐药基因芯片检测及BACTEC MGIT 960耐药性检测，将结果进行比对分析，旨在探讨耐药基因芯片检测技术在复治肺结核患者中的临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 收集本院2017年1月至2018年12月门诊和住院复治肺结核患者161例，男102例，女59例，年龄29～68（49.0±18.5）岁。复治肺结核的诊断标准参照《WS 196-2017结核病分类》卫生行业标准[7]，有下列情况之一者为复治：（1）因结核病不合理或不规则服用抗结核药物治疗≥1个月的患者；（2）初治失败或复发的患者。同时经菌型鉴定排除非结核分枝杆菌3例。本研究经本院医学伦理批准，所有患者已签署知情同意。

1.2 标本采集 161例患者各留取痰标本各2份，门诊患者留取即时痰（就诊当时咳出的痰），住院患者留取清晨痰（起床后深咳吐出的痰）。均分别送检BACTEC MGIT 960系统结核菌液体培养+药敏试验、MTB耐药基因芯片检测。质控菌株为H37Rv（ATCC27294）标准株，由国家结核参比实验室提供。

1.3 试剂与仪器 MTB耐药基因芯片试剂盒由亚能生物技术有限公司提供；朗基L96+/Y型PCR仪/基因扩增仪，购自杭州朗基科学仪器有限公司；罗氏诊断realtime PCR 扩增仪（型号：LC-480I和 Z480）、FYY-3型分子杂交仪均购自深圳亚能生物技术有限公司；Fosun生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公司；美国BD公司BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养鉴定药敏仪及其配套试剂。

1.4 MTB耐药基因芯片检验方法及结果判读

1.4.1 细菌培养、菌种鉴定及药敏试验 所有痰标本按照《结核病诊断细菌学检验规程》[8]进行BACTEC MGIT 960液体培养、菌种鉴定及药敏试验[利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）的耐药性]。

1.4.2 DNA提取 痰标本1 ml加等量4%NaOH液化后，离心半径8 cm，13 000 r/min离心5 min，混匀；离心半径8 cm，10 000 r/min离心2 min，弃上清液。向沉淀中加入50 ml细胞裂解液，打匀，沸水浴10 min，离心半径8 cm，10 000 r/min离心2 min，留上清液进行PCR。

1.4.3 膜芯片设计 经GenBank数据库检索和比对分析，设计23条特异性探针，并点样至尼龙膜上，制成膜芯片。

1.4.4 PCR扩增 取出PCR反应管，在管壁上做好标记，离心半径8 cm，50 000 r/min离心2 min，加入已提取的待测样品 DNA 4 μl。同时取两管PCR反应管分别加入阳性标本提取的DNA和阴性标本提取的DNA，作为产品使用过程的质量控制。反应体系如下：模板 DNA 20 ng、2.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μl，DNA Taq 酶2.5 U，10×PCR 缓冲液 2.5 μl。使用 ABI-7300 仪器扩增，循环条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 45 s、68 ℃ 60 s，循环次数为30；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、68 ℃60 s，循环次数为 30；68 ℃ 5 min。

1.4.5 反向斑点杂交技术 取检测膜条置15 ml离心管中，加5 ml杂交缓冲液（1×柠檬酸钠盐、0.1%十二烷基硫酸钠）和PCR产物，沸水浴10 min，58℃杂交2 h。将膜条移至装有预热洗液（0.5×柠檬酸钠盐、0.1%十二烷基钠）的50 ml管中，于58℃轻摇洗涤15 min。用杂交缓冲液配制 1∶2 000的过氧化物酶溶液，室温轻摇泡膜30 min，弃过氧化物酶液。用杂交缓冲液室温轻摇洗膜2次，5 min/次。将膜条浸泡于新鲜配制的显色液中（0.1 mol/L柠檬酸钠19 ml、2 mg/ml四甲基联苯胺 1 ml、3% H2O210 μl），避光显色 5～10 min，出现蓝色斑点即为含有相应的待检基因。

1.4.6 结果判读 阳性质控品正常显色而临床样本只有第CC位点显色，表明被检样本为阴性（即无MTB）或者样本中待检测的MTB在本试剂盒最低检出限以下。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，两种方法检测结果的一致性采用Kappa检验判读，Kappa 0.81～1几乎完全一致，Kappa0.61～0.80高度一致性，Kappa 0.41～0.60 中等一致性，Kappa0.21～0.40 一般一致性，Kappa0.0～0.20极低一致性[9]。采用χ2检验比较基因芯片法和传统比例法检测结果的差异。计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药基因芯片检测与 BACTEC MGIT 960药敏检测结果 161份痰标本中，耐药基因芯片检测共检出MTB基因阳性122份，阳性检出率为75.78%（122/161），其中野生型58份，突变型64份，耐药基因突变菌株占阳性菌株的52.50%（64/122）。在122例耐药基因芯片阳性患者中，同时BACTEC MGIT 960培养结核分枝杆菌阳性104例。对这104例患者的标本进行分析：基因芯片与BACTEC MGIT 960药敏检测同时提示耐药为54例，同时提示敏感为38例，基因芯片提示耐药而BACTEC MGIT 960药敏检测敏感为5例，基因芯片提示敏感而BACTEC MGIT 960药敏检测耐药为7例，两种方法一致率为88.46%（92/104），灵敏度为88.52%（54/61），特异度为 88.37%（38/43），阳性预测值和阴性预测值分别为 91.52%（54/59）和 84.44%（38/45）。经 χ2检验，两种方法对检测结核分枝杆菌耐药率的差异有统计学意义（χ2=60.75，P＜0.001），Kappa值为 0.764，两种方法有高度的一致性。

2.2 耐药基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏试验对RFP的耐药性检测结果 对RFP的耐药性检测，耐药基因芯片与BACTEC MGIT 960药敏检测同时提示RFP耐药为42例，同时提示RFP敏感为46例，耐药基因芯片提示RFP耐药而BACTEC MGIT 960药敏检测RFP敏感为1例，耐药基因芯片提示RFP敏感而BACTEC MGIT 960药敏检测RFP耐药为15例，耐药基因芯片结果与BACTEC MGIT 960药敏检测结果对RFP一致率为84.62%（88/104），灵敏度为73.68%（42/57），特异度为97.87（46/47），阳性预测值和阴性预测值分别为 97.67%（42/43）和 75.41%（46/61）。经 χ2检验，两种方法对检测RFP耐药率的差异有统计学意义（χ2=55.80，P＜0.001），Kappa 值为 0.713，两种方法有高度的一致性。

2.3 耐药基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏试验对INH的耐药性检测结果 对INH的耐药性检测，耐药基因芯片与BACTEC MGIT 960药敏检测同时提示INH耐药为42例，同时提示INH敏感为46例，耐药基因芯片提示INH耐药而BACTEC MGIT 960药敏检测INH敏感为5例，耐药基因芯片提示INH敏感而BACTEC MGIT 960药敏检测INH耐药为11例，耐药基因芯片结果与BACTEC MGIT 960药敏检测结果对INH一致率为84.62%（88/104），灵敏度为79.25%（42/53），特异度为90.20%（46/51），阳性预测值和阴性预测值分别为 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57）。经 χ2检验，两种方法对检测INH耐药率的差异有统计学意义（χ2=50.60，P＜0.001），Kappa 值为 0.693，两种方法有高度的一致性。

2.4 耐药基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏试验对SM的耐药性检测结果 对SM的耐药性检测，耐药基因芯片与BACTEC MGIT 960药敏检测同时提示SM耐药为28例，同时提示SM敏感为62例，耐药基因芯片提示SM耐药而BACTEC MGIT 960药敏检测SM敏感为6例，耐药基因芯片提示SM敏感而BACTEC MGIT 960药敏检测SM耐药为8例，耐药基因芯片结果与BACTEC MGIT 960药敏检测结果对SM一致率为86.54%（90/104），灵敏度为 77.78%（28/36），特异度为91.18%（62/68），阳性预测值和阴性预测值分别为82.35%（28/34）和 88.57%（62/70）。经 χ2检验，两种方法对检测SM耐药率的差异有统计学意义（χ2=50.86，P＜0.001），Kappa值为0.699，两种方法有高度的一致性。

2.5 耐药基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏检测对EMB的耐药性检测结果 对EMB的耐药性检测，耐药基因芯片与BACTEC MGIT 960药敏检测同时提示EMB耐药为12例，同时提示EMB敏感为77例，耐药基因芯片提示EMB耐药而BACTEC MGIT 960药敏检测EMB敏感为3例，耐药基因芯片提示EMB敏感而BACTEC MGIT 960药敏检测EMB耐药为12例，耐药基因芯片结果与BACTEC MGIT 960药敏检测结果对EMB一致率为85.57%（89/104），灵敏度为50.00%（12/24），特异度为96.25%（77/80），阳性预测值和阴性预测值分别为 80.00%（12/15）和 86.52%（77/89）。经 χ2检验，两种方法对检测EMB耐药率的差异有统计学意义（χ2=47.78，P＜0.001），Kappa值为 0.677，两种方法有高度的一致性。

2.6 MTB耐药基因芯片检测结果 对这104份标本进行分析，其中59株耐药基因突变的菌株，rpoB基因突变占 72.88%（43/59），katG+inhA基因突变占 79.66%（47/59），rpsL基因突变占 57.63%（34/59），embB 基因突变占25.42%（15/59），多重耐药菌株占耐药菌株的74.57%（44/59）。不同突变类型各个突变基因位点的检出情况见表1。

表1 不同突变基因在59株耐药菌株中的检出情况

3 讨论

复治患者是耐药肺结核的高发人群，马艳等[10]对全国22家医疗机构377例确诊的复治肺结核患者调查问卷显示耐药率为39.26%，而温州地区老年复治患者总耐药率高达52.27%[11]，因此，复治肺结核患者快速准确的耐药性检测[12]及指导临床用药以提高结核病治疗疗效，防止耐药MTB的产生和传播具有重要意义。由于MTB生长速度慢，传统的药敏试验周期较长，需4～8周才出结果，不能为临床提供时效性检测结果[13]，不仅影响患者的早期诊断和治疗，而且还加速了耐多药结核病的传播[14]。PCR荧光探针技术在快速诊断结核病中具有一定的的临床价值[15]，但无法检测耐药性。GeneXpert Mtb/RIF系统虽然检测MTB的灵敏度和特异度高，但仅能检测RFP rpoB基因是否发生耐药[16]，而且所需设备及试剂价格昂贵，维护成本较高，难以在基层单位广泛开展。而耐药基因芯片法检测不仅能同时检测RPF、INH、SM、EMB是否发生耐药，检测时间仅需1 d，更实用于检测复治肺结核所感染菌株的耐药性。

临床上常用的一线抗结核药RPF、INH、SM、EMB均可产生耐药。MTB耐药基因芯片检测系统根据与结核菌耐药性高度相关的5种不同耐药基因的突变位点来设计特异扩增引物，根据不同耐药基因的相应突变位点设计相应特异探针，将高敏感度的PCR技术和高通量的反向斑点杂交技术相结合的基因检测技术，可同时对导致上述4种抗结核药耐受的绝大多数的突变类型进行检测，具有快速、准确、特异、高通量的特点，成为近年来研究的热点。

本研究结果显示：在122例耐药基因芯片阳性患者中，同时BACTEC MGIT 960培养MTB阳性仅104例，考虑与临床送检标本质量有关，同时需排除死菌可能。BACTEC MGIT 960药敏检测基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏检测结果一致率为88.46%（92/104），对RPF、INH、SM、EMB耐药性检测的一致率分别为84.62%（88/104）、84.62%（88/104）、86.54%（90/104） 和 85.57%（89/104），与白雪娟等[17]结果一致，略低于林明冠等[18]报道，考虑原因：一方面与本研究是直接检测痰标本中的MTB-DNA，而林明冠是检测MTB分离株的DNA有关；另一方面与临床标本中结核分枝杆菌存在异质性耐药有关[19]。耐药基因芯片检测与BACTEC MGIT 960药敏检测结果相比，Kappa值均在0.61～0.80，提示MTB耐药基因芯片与BACTEC MGIT 960两种检测法具有高度的一致性，对RPF、INH、SM、EM的耐药性检测同样保持高度一致。与传统药敏试验相比，基因芯片技术检测对RFP耐药的灵敏度为73.68%（42/57），特异度为97.87（46/47），阳性预测值和阴性预测值分别为97.67%（42/43）和75.41%（46/61）。对INH耐药灵敏度为79.25%（42/53），特异度为90.20%（46/51），阳性预测值和阴性预测值分别为 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57），与张瑞梅等[20]研究结果相似。表明基因芯片技术在临床实际中有较好的应用价值。

本研究采用MTB耐药基因芯片检测系统进行rpoB、katG、inhA、rpsL、embB 基因突变检测，122份耐药基因芯片阳性标本中，BACTEC MGIT 960培养结核分枝杆菌阳性104份，其中59株发生耐药基因突变。国内外大量的研究数据均证明RFP的耐药性95%左右是由编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变引起，突变均发生在rpoB 507～533位的氨基酸组成的区域内[21-22]。INH的耐药性50%～70%是由编码过氧化氢酶-过氧化物酶的katG基因的315位点突变引起的，5%～10%是由烯酰基还原酶编码基因inhA的突变引起的[23]。EMB的耐药性是由编码糖基转移酶（催化阿拉伯糖聚合到阿拉伯-半乳聚糖）的embB基因的306位点突变引起[24]，SM的耐药性是由编码核糖体蛋白S12的rpsL基因突变引起[25]，多发生在43位和88位氨基酸上。本研究结果显示rpoB基因突变占72.88%（43/59），其中531位点突变发生率最高为47.46%（28/59），与李丽等[26]研究结果一致。katG+inhA基因突变占79.66%（47/59），其中katG315位密码子突变 66.1%（39/59），inhA-15位突变13.56%（8/59）。rpsL 基因突变占 57.63%（34/59），embB基因突变占25.42%（15/59），其中多重耐药菌株占耐药菌株的74.57%（44/59），说明温州地区复治肺结核患者一线抗结核药物的耐药率高。

综上所述，目前温州地区复治肺结核耐药形式严峻，尤其耐多药结核面临严重挑战[27]。MTB耐药基因芯片检测系统能够快速的进行结核分枝杆菌诊断检测及一线结核药物耐药性监测，且与BACTEC MGIT 960液体培养及药敏试验保持高度一致，可成为筛查结核分枝杆菌耐药的快速有效的方法，为临床提供准确、及时、有效的实验室检查依据，使患者及时得到有效的治疗，避免继发耐药性的产生，节省医疗成本，控制传播和预后，对复治肺结核患者具有很好的临床应用价值。