[Gly14]-humanin对人脐静脉内皮细胞胆固醇外排的促进作用研究

祝娃娃 王健达 张险峰 俞灵莺

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是由于动脉内膜在早期局部损伤后，胆固醇尤其是氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL） 引起血管壁脂质堆积，进而导致动脉内膜纤维组织增生以及内膜增厚，最后形成动脉粥样斑块[1-2]。细胞内胆固醇酯主要受清道夫受体和胆固醇逆转录蛋白调节[3]。胆固醇逆转录蛋白如腺苷三磷酸结合盒转运体A-1（ABCA-1）和腺苷三磷酸结合盒转运体G-1（ABCG-1）在游离胆固醇流出中起主要作用[4-6]。ABCA-1和ABCG-1协同作用维持细胞内胆固醇摄取和流出的动态平衡，阻止脂质在细胞内蓄积继而泡沫化[7]。

Humanin（HN）是一种内源性抗细胞凋亡多肽，2001年首次在阿尔茨海默病患者大脑中发现，在许多细胞里起抗氧化、细胞保护、抗炎症的作用[8-9]。[Gly14]-humanin（HNG）是HN肽链第14位氨基酸甘氨酸取代色氨酸形成的，与HN相比，在阿尔茨海默病患者中其细胞保护活性提高了将近1 000倍[10]。本课题组前期研究表明外源性给予HNG可以通过抑制脂质摄取从而减少ox-LDL在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的聚集[11]，然而HNG对内皮细胞脂质外排的具体机制还有待进一步研究。因此本研究拟探讨HNG对ox-LDL诱导的内皮细胞胆固醇外排的作用，进而阐明在HUVECs中HNG对ABCA-1和ABCG-1蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 HUVECs购自上海凯基生物有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 HNG购自美国Sigma-Aldrich公司；ox-LDL购自中国奕源生物公司；ABCA-1兔单克隆抗体购自英国Abcam公司；ABCG-1兔单克隆抗体购自美国Immunoway公司；凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；酶联免疫检测仪购自美国Tecan公司Infinite 200。Power PAC2000电泳仪购自美国Bio-Rad公司；垂直电泳槽、转移电泳槽均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞复苏 取出HUVECs细胞冻存管迅速置于37℃的水浴锅中持续快速振荡使细胞融化；先吸取5 ml DMEM培养基，再快速从冻存管吸取2 ml细胞液，置于15 ml离心管中，1 200 r/min离心5 min，吸出上清液，加入含10%小牛血清的DMEM完全培养基5 ml中，混匀后将细胞悬液加入细胞培养皿中，吹打均匀，置于37℃、含5% CO2的培养箱培养。

1.3.2 细胞传代 从培养箱中取出贴壁生长近100%的细胞，吸出上清液，加入1.0 ml的0.25%Trypsin，静置1 min，至细胞触角开始回缩；吸去培养皿中的培养液，加入含10%FBS的DMEM培养基混匀，以1∶4种入新的培养皿，最后放置37℃、5% CO2的培养箱培养。

1.3.3 HUVECs细胞分组与处理 将对数生长期的HUVECs细胞接种于6孔板中并随机分组，其中采用ox-LDL 处理的5组：0 μg/ml ox-LDL组、30 μg/ml ox-LDL组、60 μg/ml ox-LDL 组、90 μg/ml ox-LDL 组、120 μg/ml ox-LDL组；采用HNG处理的5组：0 nM HNG组、50 nM HNG 组、100 nM HNG 组、1 μM HNG 组、10 μM HNG组；联合用药处理的5组：空白组、ox-LDL组、ox-LDL+100 nM HNG 组、ox-LDL+1 μM HNG 组、ox-LDL+10 μM HNG组，分别使用不同浓度的HNG预处理HUVECs细胞1 h，随之加入60 μg/ml ox-LDL；经培养及不同药物浓度作用12 h后收集细胞样品。另设HNG作用不同时间 5组：0 h HNG 组、3 h HNG 组、6 h HNG 组、12 h HNG组、24 h HNG组，将1 μM的HNG按上述时间处理细胞后再收集细胞样品。

1.3.4 ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。用预冷的PBS洗涤HUVECs细胞2次以上，加入100 μl的RIPA细胞裂解液，4℃、13 200 r/min离心15 min，取上清液，进行蛋白质定量后，常规进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为50 μg，转膜、封闭后转印至膜，加入兔单克隆抗体ABCA-1或兔单克隆抗体ABCG-1和β-actin作为一抗，4℃孵育过夜后，加入与一抗所相对应的二抗，ECL化学发光，分析条带的灰度值并与各自的内参β-actin的比值来判断目的蛋白的表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度ox-LDL处理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平比较 与 0 μg/ml ox-LDL 组相比，60、90、120 μg/ml ox-LDL组ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1和表1。

图1 不同浓度氧化低密度指蛋白（ox-LDL）处理后腺苷三磷酸结合盒转运体A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸结合盒转运体G-1（ABCG-1）蛋白表达的电泳图（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表1 不同浓度ox-LDL处理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平比较

2.2 不同浓度HNG处理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平比较 与0 nM HNG组相比，1、10 μM HNG组ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2和表2。

2.3 不同时间HNG处理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平比较 与0 h HNG组相比，12、24 h HNG组ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3和表3。

2.4 HNG与ox-LDL联合处理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表达水平比较 与空白组比较，ox-LDL组ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）；而与 ox-LDL 组相比，ox-LDL+1 μM HNG 组、ox-LDL+10 μM HNG 组 ABCA-1、ABCG-1 蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 4 和表 4。

图2 不同浓度[Gly14]-humanin（HNG）处理后腺苷三磷酸结合盒转运体A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸结合盒转运体G-1（ABCG-1）蛋白表达的电泳图（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表2 不同浓度HNG处理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表达水平比较

图3 不同时间[Gly14]-humanin（HNG）处理后腺苷三磷酸结合盒转运体A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸结合盒转运体 G-1（ABCG-1）蛋白表达的电泳图（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

3 讨论

动脉内膜下沉积过量的胆固醇尤其是ox-LDL并逐渐形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的主要特征，ox-LDL是慢性冠脉疾病的重要危险因子，是导致动脉粥样斑块形成和斑块不稳定性重要原因[12-13]。血液中的ox-LDL逐渐被酯化、处理、储存和聚集成细胞脂质滴沉积在血管内膜下，从而导致泡沫细胞形成[14]。ox-LDL浓度与动脉粥样硬化进程呈正相关，是引起动脉粥样硬化最危险的因子[15]。清道夫受体介导的ox-LDL的摄取和逆转录受体介导的胆固醇外排是调节脂质代谢平衡两条关键途径[16]。他汀类药物可通过抑制TC和LDL水平而降低血脂及稳定斑块等起到抗动脉粥样硬化的重要作用，但长期使用该类药物会引起肝毒性和肌溶症等不良反应而影响它的临床应用。而积极寻找一种新的毒性低、疗效好的降脂药物可能对动脉粥样硬化的治疗很有应用前景。

表3 不同时间HNG处理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表达水平比较

图4 [Gly14]-humanin（HNG）与氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）联合处理后腺苷三磷酸结合盒转运体A-1（ABCA-1）和腺苷三磷酸结合盒转运体 G-1（ABCG-1）蛋白表达的电泳图（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表4 HNG与ox-LDL联合处理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表达水平比较

HN是一种由24个氨基酸所组成的抗凋亡多肽，能够对抗由淀粉样蛋白D所诱导的神经细胞凋亡[17]。HN也参与了动脉粥样硬化的发生、发展，在动脉粥样硬化患者颈动脉脂质斑块及人类血管内皮细胞和中均发现有HN的表达[18]。研究表明，使用HNG干预高脂饮食诱导的小鼠后，可增加肝微粒体甘油三酯转移蛋白（MTTP）的表达并促进肝脏TG的分泌，而显著降低小鼠体内肝TG的蓄积[19]。笔者前期研究发现，HNG通过抑制植物凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）入胞，减少ox-LDL在血管内皮细胞的聚集[11]。然而，HNG对内皮细胞脂质外排的具体机制还有待进一步的研究。

细胞内胆固醇从血管壁外排到细胞外的受体，主要包括ABCA-1和ABCG-1受体[3]。ABCA-1是胆固醇外排最重要的逆转录受体，在人和动物中，ABCA-1对动脉粥样硬化的保护起到了关键的作用，敲减ABCA-1基因会增加细胞内胆固醇的聚集[20]。此外，许多种具有抗动脉粥样硬化作用的药物，例如槲皮素、Apelin-13及大蒜提取主要成S-烯丙基半胱氨酸等都能增加ABCA-1的表达，而促进巨噬细胞胆固醇的流出[21-23]。除了ABCA-1对脂质外排的重要作用外，逆转录受体ABCG-1在胆固醇逆转录中也发挥重要作用。以往研究显示多种物质包括桉树酚（在茶和草本的一个小芳香化合物）和岩藻甾醇（海藻中丰富的胆固醇）可通过激活肝脏X受体（LXR）和类视黄醛受体（RXR）而增加ABCG-1的表达[24-25]。ABCG-1基因敲除后可明显减少巨噬细胞逆转录的作用，而增加ABCG-1的表达后可显著促进巨噬细胞胆固醇的外排进而抑制泡沫细胞的形成[26]。

综上所述，ABCA-1和ABCG-1在胆固醇外流起着关键作用。笔者在本实验中，通过Western blot法检测ABCA-1和ABCG-1蛋白的表达。在ox-LDL诱导下，随着ox-LDL浓度的增加，ABCA-1和ABCG-1蛋白的表达逐渐增加。而HNG单独处理后，ABCA-1和ABCG-1的蛋白表达随着浓度和时间的增加而逐渐增加，表明HNG单独处理可以促进HUVECs细胞脂质的外排。最后，HNG与ox-LDL联合作用后，HUVECs细胞ABCA-1和ABCG-1的蛋白表达比ox-LDL单独处理后的表达量显著增加。总之，降脂治疗已经被证实能够降低临床事件的发生，HNG在HUVEC内皮细胞的保护作用中，为我们提供了新的见解。HNG有减少内皮细胞脂质蓄积的作用，可能成为预防动脉粥样硬化发展新的合适研究药物。