贯叶连翘提取物对大鼠急性偏头痛模型的改善作用研究

张丹丹 杜惠 毛祈萍 李会英 何明珍 陈巧巧 欧阳辉

偏头痛是一种常见的慢性神经系统疾病，症状以搏动性头痛为主，发作时伴有中度至重度疼痛，随着运动或身体活动而加剧[1]。偏头痛在中医学中多属内伤头痛，属于中医“头风”“脑风”“偏头痛”“厥头痛”等疾病范畴[2]。目前，偏头痛的发病机制尚不明确，主流学说有血管源学说、皮层扩散抑制学说和三叉神经血管学说。贯叶连翘为藤黄科金丝桃属多年生草木植物，是国际医药市场上重要的抗抑郁植物制剂原料[3]。偏头痛与焦虑抑郁存在共病机制[4]，抑郁症发病机制亦与偏头痛呈现同样的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）等神经递质水平下降[5]。临床上首选抗抑郁药物多以增加突触单胺类神经递质5-HT、DA、NE的水平为主[6]。因此偏头痛与抑郁症的神经病理生化基础均可能与5-HT等神经递质水平降低有关[7-8]，但能升高5-HT水平的抑郁症药物是否可以治疗偏头痛，仍然需要更多的证据。本研究将贯叶连翘提取物用于硝酸甘油所致急性偏头痛大鼠，并测定大鼠血浆5-HT、DA、内皮素（ET）以及脑组织前列腺素E2（PGE2）水平，以探究贯叶连翘提取物对偏头痛是否具有治疗作用，也为抗抑郁药物和抗偏头痛药物的共性机制研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠48只（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格号：SLK-2001-02），体重（200±20）g。实验前适应性喂养7 d，禁食12 h（自由饮水）。本研究动物实验在江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心进行，经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号JZLLSC2019-0160）。药物和试剂：贯叶连翘（杭州今同公司）；佐米曲普坦（2.5 mg/片，杭州康恩贝制药有限公司）；硝酸甘油注射液（5 mg/ml，山东圣鲁制药有限公司，规格1 ml∶5 mg）；DA测定试剂盒、ET测定试剂盒、5-HT测定试剂盒、PGE2测定试剂盒（南京建成生物研究所）。

1.2 贯叶连翘提取物的制备 将100 g贯叶连翘干燥药材放入圆底烧瓶加入10倍量的水浸泡1 h后加热提取2次（100℃，每次1 h），将2次提取液过滤合并，用旋转蒸发仪浓缩，在70℃水浴锅上蒸干得浸膏，计算得率（得率=浸膏重量/贯叶连翘重量×100%）为28.44%，将浸膏粉碎成细粉，放入干燥皿中保存待用。

1.3 动物分组、造模与给药方法 将48只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、佐米曲普坦组、贯叶连翘高剂量组、贯叶连翘中剂量组、贯叶连翘低剂量组，每组各8只。除正常对照组外[正常对照组皮下注射 0.9%氯化钠注射液 10 mg/kg（规格：100 ml∶0.9 g）]，其余各组大鼠采用后颈部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg方法制备急性偏头痛模型，以大鼠30 min内出现双耳变红、前肢频繁挠头、爬笼次数增加为造模成功[9]。造模成功30 min后给药，佐米曲普坦组灌胃佐米曲普坦1.0 mg/kg[10]（用0.9%氯化钠注射液溶解）；剂量设计结合文献[11]，并参考预实验结果，贯叶连翘高剂量组灌胃贯叶连翘提取物0.6 g/kg，贯叶连翘中剂量组灌胃贯叶连翘提取物0.3 g/kg，贯叶连翘低剂量组灌胃贯叶连翘提取物0.15 g/kg，正常对照组与模型组灌胃0.9%氯化钠注射液10 mg/kg。

1.4 取材与指标检测 于给药2 h后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液0.4 ml/100 g麻醉，腹主动脉取血5 ml，离心（4 ℃，3 000 r/min，10 min），取上清液（血浆），测定血浆中5-HT、DA、ET水平。大鼠取血后脱颈椎处死，剪下头部取出全脑，将其置于盛有0.9%氯化钠溶液的培养皿中，洗去血渍，吸干多余水分，保存于-20℃冰箱中备用，用于PGE2水平的检测。采用ELISA试剂盒（南京建成生物研究所）测定血浆5-HT、DA、ET及脑组织PGE2水平，严格按照说明书操作。因取血及试剂盒数量等原因，最终各组纳入统计大鼠只数有所不同。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆5-HT水平比较 与正常对照组比较，佐米曲普坦组与贯叶连翘高、中、低组差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与模型组比较，贯叶连翘高、中、低剂量组显著增高（P＜0.05或0.01），佐米曲普坦组有上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与佐米曲普坦组比较，贯叶连翘高、中剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），低剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血浆5-HT水平比较（ng/ml）

2.2 各组大鼠血浆DA水平比较 与正常对照组比较，佐米曲普坦组显著增高（P＜0.01），贯叶连翘低剂量组显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，佐米曲普坦组和贯叶连翘高、中剂量组显著增高（均P＜0.01），贯叶连翘低剂量组有上调，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与佐米曲普坦组比较，贯叶连翘高、中、低剂量组差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表2。

2.3 各组大鼠血浆ET水平比较 与正常对照组比较，佐米曲普坦组与贯叶连翘高、中、低组差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与模型组比较，佐米曲普坦组与贯叶连翘高、中、低剂量组显著增高（均P＜0.01），与佐米曲普坦组比较，贯叶连翘高、中、低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 各组大鼠血浆DA水平比较（ng/ml）

表3 各组大鼠血浆ET水平比较（ng/ml）

2.4 各组大鼠脑组织PGE2水平比较 与正常对照组比较，贯叶连翘中剂量组显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，佐米曲普坦组显著增高（P＜0.05），贯叶连翘高、中、低剂量组均显著增高（均P＜0.01）；与佐米曲普坦组比较，贯叶连翘高、低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），贯叶连翘中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠脑组织PGE2水平比较（ng/ml）

3 讨论

急性偏头痛发作时的治疗在于快速缓解疼痛，目前使用的药物包括曲坦类药物、非甾体抗炎药（NSAIDs）、联合巴比妥类镇痛药、可待因、吗啡等阿片类镇痛药物和麦角胺加咖啡因[12]。曲坦类药物除了具有显著的疗效和良好的安全性外，还是治疗偏头痛的首选药物。研究发现，口服曲坦类药物中，佐米曲普坦的疗效优于舒马曲坦[1]，是目前偏头痛一线用药中的主要药物，因此本研究选用佐米曲普坦作为阳性对照药物。硝酸甘油诱导的急性偏头痛模型大鼠是经典的实验性偏头痛动物模型[13-14]，造模后的行为学指标、生理生化指标与偏头痛患者发作时症状较吻合，该造模方式能较好地反应药物的抗偏头痛效果。

贯叶连翘是国际上销量较大，药用价值较高的天然药物，传统民间用法为水煎液服用，近年来也有将醇提物做为标准提取物进行提取销售。因此贯叶连翘水提取和醇提物可能都有效，目前对醇提物中的金丝桃素等成分药效研究较多，而水提物的现代研究较少，故实验中根据其民间用法选取了水提取进行预实验并最终确定了正式试验的高、中、低给药剂量。贯叶连翘主要用于抗抑郁，由于抑郁症和偏头痛存在共病机制，某些生理生化指标的趋势一致，因此贯叶连翘提取物可能也可治疗偏头痛，值得深入探讨。

近年来研究发现血小板释放的5-HT[15]、DA、ET、神经肽如P物质、缓激肽、降钙素基因相关肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）和 β-内啡肽（β-endorphin，β-EP）等[16]、由环氧化物形成的血栓烷素（Thromboxane，TXA2）、前列腺素（prostaglandin，PG）如 PGE2、PGI2[17]均可能与偏头痛有关。在生理生化指标的选择上，本研究综合了大量的文献，结合现有一线化学药物的起效特点，选择了具有代表性的5-HT、ET、DA、PGE2指标。有研究表明，偏头痛患者体内5-HT代谢紊乱，发病期间血浆5-HT水平较低，血小板5-HT水平和释放增加[18]。5-HT是目前公认在偏头痛发病中起重要作用的神经递质，在偏头痛发作期血浆5-HT水平是降低的[19]。DA是一种儿茶酚胺类神经递质，在中枢神经系统中水平较高。临床研究、生化研究和药理学研究均表明DA在偏头痛的发病机制中起着重要的作用[20]。ET由血管内皮细胞产生，是一种很强的缩血管物质[5]，ET血管活性物质水平的异常变化会促进偏头痛的发生[21-22]。前列腺素（PGE2、PGI2、PGD2、PGF2α）不仅介导外周炎症，还参与中枢神经系统病理生理的调节过程，其中PGE2、PGI2对疼痛的信号处理过程有重要作用[23]。贯叶连翘是抗抑郁症的常用中药，贯叶连翘提取物能抑制5-HT、DA、NE等单胺类神经递质的摄取，使脑部抑郁相关的神经递质浓度发生变化[24]。

研究表明，贯叶连翘能改变慢性应激大鼠脑内单胺类神经递质的水平，并具有类似抗慢性应激的功效[18]。贯叶连翘能提高慢性应激大鼠纹状体中DA水平，引起海马和纹状体中HVA与5-HT水平出现升高。本实验结果显示贯叶连翘提取物对5-HT和DA的调节趋势与文献研究一致，进一步分析发现，贯叶连翘提取物对血浆5-HT水平的调节作用优于佐米曲普坦，对DA水平的调节作用较佐米曲普坦弱。此外，贯叶连翘提取物对ET、PGE2也有一定的调节作用，且作用效果与佐米曲普坦一致。提示贯叶连翘提取物可通过影响神经递质以及血管活性因子的水平，可能对偏头痛具有很好的改善作用，贯叶连翘提取物对神经递质的调节作用与抗偏头痛中成药大川芎方、天麻钩藤饮、正天丸等接近，但对ET、PGE2的调节作用更优，具有潜在的开发价值[25]。

综上所述，贯叶连翘提取物对大鼠体内5-HT、DA、ET、PGE2水平具有一定的调节作用，并对硝酸甘油所致大鼠急性偏头痛有一定的改善作用。下一步，还应该采取液质联用等方法分析水提物的成分，并测试贯叶连翘提取物对偏头痛行为学指标如挠头次数、耳红时间等的影响，进一步确认药物对偏头痛的药效物质及作用。