碱性条件下生物修复吡啶污染菌株的筛选及表征

翟 赟，刘建忠，易红磊，周 卫，陈 俊，黄 皓，秦晓蓉

(武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉 430081)

吡啶是一种重要的工业生产原料，也是一种危害性极大的环境污染物。吡啶及其衍生物的用途非常广泛[1]，现代工业生产每天都会产生数以百万吨的含吡啶及其衍生物的工业污水。吡啶及其衍生物具有致畸性，也是潜在的致癌物[2]，若长期暴露在含吡啶环境中会出现身体不适甚至患上疾病[3]。目前，对含吡啶及其衍生物污水的处理方法有物理化学法[4-6]和微生物法，物理化学法存在运作成本高、产生二次污染等缺点[7]；而微生物法具有环境友好、运作成本较低、可有效避免二次污染等优点。Stobdan等[8]报道了一株戈登氏菌属菌株，该菌株能在192 h内将初始浓度为5 537 mg·L-1的吡啶完全降解，这是至今报道的微生物可降解吡啶的最高浓度；Bai等[9]和Shen等[10]报道的可降解吡啶的初始浓度分别为2 614 mg·L-1和2 600 mg·L-1；更多的报道在1 000 mg·L-1以下[11-12]，且对pH值的适用范围较窄，多为中性或略偏碱性。

为筛选能在极端pH值环境下有效降解吡啶的菌株，将其用于吡啶污染的原位生物修复，作者以吡啶为唯一碳源和氮源，从某焦化厂污水处理系统中筛选吡啶高效降解菌株，检测其生理生化特征，鉴定其分类学地位，并研究其在碱性条件下对吡啶的降解效果。

1 实验

1.1 材料、试剂与培养基

活性污泥，采自某焦化厂污水处理系统。

吡啶储存液(1×105mg·L-1)，抽滤灭菌后储存于已灭菌和干燥的棕色试剂瓶中，备用；其余试剂均为分析纯，购自武汉市各药品经销商。

富集培养基(LB)，pH值为7.0～7.2(以2 mol·L-1NaOH溶液调节)，121 ℃高压灭菌15 min；无机盐培养基(MSM)，参照文献[13]方法配制，pH值为8.0～11.0(以NaOH储存液调节)，121 ℃高压灭菌15 min。

1.2 菌株的筛选

取适量的活性污泥样品，搅拌均匀，接入经高压灭菌处理的LB培养基中，于35 ℃、150 r·min-1振荡培养48 h；采用逐步提高吡啶浓度的方法对富集培养液中的菌群驯化3轮；取1 mL驯化培养液，用磷酸盐缓冲液梯度稀释后涂布吡啶浓度为500 mg·L-1的MSM琼脂平板，于35 ℃培养箱中培养，选取色泽、形态存在差异的菌落进行划线纯化。

1.3 菌落的形态、生理生化特征及分子生物学鉴定

菌落的形态特征采用裸眼观察，用游标卡尺测定一定数目菌落的直径，统计菌落的大小范围。

采用标准的操作程序完成革兰氏和芽孢染色，于显微镜下放大100倍观察染色结果；其它生理生化特征的测定参照文献[13]方法进行，包括V-P试验、淀粉水解试验和尿酶试验等。

使用BLAST软件对NCBI数据库中的16S rRNA核苷酸序列进行搜索，应用ClustalW算法进行逐对和多重序列比对，以核苷酸序列同源性作为初步判断菌株种属的依据。

1.4 碱性条件下菌株降解吡啶实验

1.4.1 种子液的制备

将1 mL驯化培养液接入吡啶初始浓度为1 000 mg·L-1的MSM培养基中，直到对数生长晚期。将培养液移入50 mL离心管，离心回收菌体；以适量不含吡啶的MSM培养基重悬沉淀，离心回收菌体；再以适量不含吡啶的MSM培养基重悬沉淀，并将悬液的OD600值调至1.0，作为种子液。

1.4.2 吡啶降解实验

在MSM培养基初始pH值分别为8.0、10.0和11.0时，考察菌株对不同初始浓度(300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1、2 500 mg·L-1)吡啶的降解效果。培养液总体积为100 mL，吡啶按设计要求由储存液经稀释后加入，种子液的接入量为5 mL，培养温度为35 ℃，摇床转速为150 r·min-1，每隔12 h取一次样，采用比色法测定吡啶浓度(256 nm)及菌体生物量(600 nm)，计算吡啶降解率及菌体生物量。每组实验设3个平行。

2 结果与讨论

2.1 吡啶降解菌株的筛选

经过数周的富集、驯化和分离，得到13株能以吡啶为唯一碳源和氮源生长的菌株。经过摇瓶初步降解实验，编号为Py-5的菌株表现出突出的吡啶降解能力，将其命名为WUST-py。

2.2 吡啶降解菌株的表征

菌株WUST-py于35 ℃培养3 d后的菌落呈球形，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，呈橘黄色，菌体不透明，直径为0.5～2.0 mm。

菌株WUST-py革兰氏染色、H2S以及尿酶试验的结果均呈阳性，能够利用葡萄糖；而甲基红、柠檬酸、V-P试验、吲哚试验以及淀粉水解试验的结果均呈阴性，不能利用蔗糖；能形成芽孢。

菌株WUST-py的16S rRNA基因部分核苷酸序列 (1 393 bp) 由武汉擎科创新生物技术有限公司测定，已成功提交到GenBank，接收号为KY658456。采用BLAST软件将该序列与提交到GenBank中其它菌株该基因序列进行同源性比对。结果表明，菌株WUST-py与红球菌属(Rhodococcussp.)菌株D-50和WB1的同源性均高达99%，故将该菌株鉴定为红球菌属。

2.3 吡啶降解菌株在碱性条件下对吡啶的降解效果

2.3.1 初始pH值为8.0时的降解效果

在MSM培养基初始pH值为8.0时，菌株WUST-py对不同初始浓度吡啶的降解效果如图1所示。

1～6，吡啶初始浓度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由图1a可知，在MSM培养基初始pH值为8.0时，菌株WUST-py分别在60 h、72 h、96 h、96 h和108 h内将初始浓度分别为500 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1和1 800 mg·L-1的吡啶降解至检测不出的水平，1 800 mg·L-1是菌株WUST-py能够完全降解吡啶的最高浓度；当吡啶初始浓度高达2 500 mg·L-1时，菌株WUST-py对吡啶基本没有降解作用。培养液中吡啶的减少很大程度上是由于吡啶的挥发所致。

由图1b可知，在MSM培养基初始pH值为8.0时，菌株WUST-py对不同初始浓度吡啶的降解均出现明显的生长延滞期(24～48 h)，且随吡啶初始浓度的增大，生长延滞期逐渐延长，这是由吡啶抑制性底物的化学本质决定的。而且由于吡啶环上引入N原子，更提高了其稳定性和抗降解性，所以微生物降解吡啶时的生长延滞期明显长于微生物降解苯酚时的生长延滞期。

2.3.2 初始pH值为10.0时的降解效果

在MSM培养基初始pH值为10.0时，菌株WUST-py对不同初始浓度吡啶的降解效果如图2所示。

1～6，吡啶初始浓度(mg·L-1)：500、1 000、1 400、1 600、1 800、2 500

由图2a可知，与MSM培养基初始pH值为8.0时的降解曲线相比较，菌株WUST-py在初始pH值为10.0时完全降解初始浓度为500 mg·L-1和1 400 mg·L-1的吡啶所需时间完全相同，均分别为60 h和96 h，但完全降解初始浓度为1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1的吡啶所需时间则均延长了12 h。

比较图1b和图2b，并不能得出MSM培养基初始pH值的增大会导致菌株WUST-py生长延滞期延长的结论，在很大程度上菌株WUST-py在MSM培养基初始pH值为8.0和10.0时表现出的生长延滞期是一致的。

Mathur等[3]报道，在初始pH值为10.0时，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在150 h内对100 mg·L-1吡啶的降解率分别为40%和25%。菌株WUST-py在MSM培养基初始pH值为10.0时对吡啶的降解能力远高于文献报道的两株菌株。

2.3.3 初始pH值为11.0时的降解效果

考虑到碱性增强对微生物活性的影响较大，在进行降解实验时有意降低了吡啶的初始浓度，旨在验证菌株WUST-py在较强碱性条件下降解吡啶的潜力。在MSM培养基初始pH值为11.0时，菌株WUST-py对不同初始浓度吡啶的降解效果如图3所示。

1～6，吡啶初始浓度(mg·L-1)：300、500、700、1 000、1 600、2 500

由图3a可知，当MSM培养基初始pH值为11.0时，菌株WUST-py分别在36 h、48 h、60 h、72 h、108 h内将初始浓度分别为300 mg·L-1、500 mg·L-1、700 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。MSM培养基初始pH值为11.0时，菌株完全降解500 mg·L-1吡啶所需的时间短于MSM培养基初始pH值为8.0和10.0时的，菌株完全降解1 000 mg·L-1吡啶所需的时间短于MSM培养基初始pH值为10.0时的，与MSM培养基初始pH值为11.0时的时间完全相同，很大程度上是由于不同批次种子液之间菌体活力的差异所造成的。

由图3b可知，MSM培养基初始pH值增大至11.0并没有显著延长菌株的生长延滞期。

Mathur等[3]报道，在初始 pH 值为 11.0 时，菌株S.putrefaciens和B.sphaericus在 150 h 内对 100 mg·L-1吡啶的降解率小于20%。菌株WUST-py在碱性条件下降解吡啶的机理有待于深入研究，初步推断菌株WUST-py是一株产酸菌，能在降解吡啶的过程中产生大量的有机酸，并以此中和培养液中的碱，从而缓解了碱性条件对菌株生长强烈的抑制作用，有利于菌株的生长和对吡啶的降解。

菌株WUST-py降解吡啶的理想pH值为8.0，与文献[14-15]报道的中性或偏碱性(pH值7～8)是微生物降解吡啶的理想pH值一致，所不同的是菌株WUST-py对初始pH值不敏感，MSM培养基初始pH值的增大，只是让降解时间稍微延长，或者降解吡啶的最高浓度稍微降低。

3 结论

从某焦化厂污水处理系统曝气池中筛选得到一株吡啶高效降解菌株，将其命名为WUST-py。该菌株为革兰氏阳性菌且有芽孢，经16S rRNA基因核苷酸序列同源性比对，鉴定为红球菌属(Rhodococcussp.)。在35 ℃、150 r·min-1条件下，当MSM培养基初始pH值为8.0时，该菌株能在108 h内将初始浓度为1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；当MSM培养基初始pH值为10.0时，该菌株能在120 h内将初始浓度为1 800 mg·L-1的吡啶完全降解；当MSM培养基初始pH值为11.0时，该菌株依然能够在108 h内将初始浓度为1 600 mg·L-1的吡啶完全降解。该菌株在用于碱性条件下吡啶污染区域的原位生物修复中具有明显的优势和较大的应用潜力。