地黄多糖脱蛋白工艺研究

刘冲英，陈子龙，王 睿，李 瑾，陈 艳，张丽华，赵 鹏*

(1.陕西中医药大学药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046; 2.渭南市食品药品检验所，陕西 渭南 714000；3.渭南市市场监督管理局，陕西 渭南 714000)

中药地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)是玄参科植物地黄的根，根据其入药形式可分为鲜地黄、生地黄、熟地黄、地黄炭等。地黄最早记载于《神农本草经》中，具有滋阴、补血、降血糖等功效，被列为补益类中药的上品。此外，地黄也可作为保健品，用途广泛[1]。

多糖是地黄的重要活性成分之一，具有抗氧化[2]、调节血糖和血脂[3]、增强免疫功能[4-5]、促进造血功能[6-7]等多种生物活性作用[8-9]。但地黄粗多糖中蛋白质杂质的存在极大地影响了多糖的生物活性，使多糖质量难以控制。目前，常用的多糖脱蛋白方法有Sevage法、盐酸法和三氯乙酸法等[10-13]，这些方法存在多糖保留率低、有机溶剂使用量大等缺点。因此，亟需开发适用于地黄多糖脱蛋白的工艺。生物酶法脱蛋白由于具有特异性较强、效率高、酶用量少、污染小且不会对多糖的结构造成破坏等优点，受到了研究者的广泛关注[14-15]。基于此，作者以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化地黄多糖的酶法脱蛋白工艺条件，以期为进一步深入研究地黄多糖奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

地黄粗多糖，自制。

小牛血清白蛋白，生物级，上海麦克林生化科技有限公司；考马斯亮蓝G250(分析纯)、木瓜蛋白酶(活力>2400 U·mg-1)，百灵威科技有限公司；无水乙醇、乙醚、苯酚、浓硫酸、三氯甲烷、正丁醇等均为国产分析纯。

HHS型恒温水浴锅，巩义予华仪器厂；AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-265型紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.2 地黄多糖脱蛋白

配制15 mg·mL-1的地黄粗多糖溶液50 mL，加入一定量的木瓜蛋白酶，置于一定温度的水浴中，搅拌下保温一段时间；3 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，浓缩后醇沉，过滤，收集滤饼，烘干，即得脱蛋白的地黄多糖。

采用考马斯亮蓝染色法[16]测定地黄多糖中蛋白含量，蛋白脱除率按式(1)计算：

(1)

式中：c0、c1分别为地黄多糖在脱蛋白前、后的蛋白含量。

采用苯酚硫酸法[17]测定地黄多糖含量，多糖保留率按式(2)计算:

(2)

式中：M0、M1分别为脱蛋白前、后地黄多糖含量。

1.3 脱蛋白工艺优化

以木瓜蛋白酶用量(以地黄多糖质量计)、脱蛋白温度、pH值、脱蛋白时间为考察因素,以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，进行单因素实验。 在单因素实验的基础上，选择木瓜蛋白酶用量(X1)、脱蛋白温度(X2)、脱蛋白时间(X3)进行3因素3水平的响应面实验。由于在各因素水平下，多糖保留率变化不大，因此，选择地黄多糖的蛋白脱除率为评价指标。响应面实验的因素与水平见表1。

表1 因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 木瓜蛋白酶用量

在脱蛋白温度为50 ℃、pH值为7、脱蛋白时间为75 min的条件下，考察木瓜蛋白酶用量对地黄多糖脱蛋白效果的影响，结果如图1所示。

图1 木瓜蛋白酶用量对蛋白脱除率及多糖保留率的影响

由图1可知，随着木瓜蛋白酶用量的增加，地黄多糖的蛋白脱除率呈上升趋势；当木瓜蛋白酶用量超过1.0%后，蛋白脱除率几乎不变。在整个过程中，多糖保留率变化不大。因此，确定适宜的木瓜蛋白酶用量为1.0%。

2.1.2 脱蛋白温度

在木瓜蛋白酶用量为1.0%、其它条件同2.1.1下，考察脱蛋白温度对地黄多糖脱蛋白效果的影响，结果如图2所示。

图2 脱蛋白温度对蛋白脱除率及多糖保留率的影响

由图2可知，随着脱蛋白温度的升高，地黄多糖的蛋白脱除率呈上升趋势，当脱蛋白温度达到60 ℃时，蛋白脱除率达到最高；继续升高脱蛋白温度，蛋白脱除率呈下降趋势。说明，温度的升高有助于提高木瓜蛋白酶的活性，从而有效提高了蛋白脱除率；而温度过高时，会造成部分酶变性失活，降低了木瓜蛋白酶降解蛋白的能力。在整个过程中，多糖保留率变化不大。因此，确定适宜的脱蛋白温度为60 ℃。

2.1.3 pH值

在脱蛋白温度为60 ℃、其它条件同2.1.2下，考察pH值对地黄多糖脱蛋白效果的影响，结果如图3所示。

图3 pH值对蛋白脱除率及多糖保留率的影响

由图3可知，随着pH值的增大，地黄多糖的蛋白脱除率和多糖保留率均呈先上升后下降趋势，当pH值为7时，地黄多糖的蛋白脱除率和多糖保留率均最高。这是因为，在中性环境中木瓜蛋白酶的活性最高，碱性环境会破坏酶的活性从而造成蛋白脱除率下降；此外，酸碱环境对多糖保留率的影响均较大。因此，确定适宜的pH值为7。

2.1.4 脱蛋白时间

在pH值为7、其它条件同2.1.3下，考察脱蛋白时间对地黄多糖脱蛋白效果的影响，结果如图4所示。

图4 脱蛋白时间对蛋白脱除率及多糖保留率的影响

由图4可知，随着脱蛋白时间的延长，地黄多糖的蛋白脱除率呈上升趋势，当脱蛋白时间为105 min时，蛋白脱除率最高；继续延长脱蛋白时间，蛋白脱除率呈下降趋势。在整个过程中，多糖保留率变化不大。因此，确定适宜的脱蛋白时间为105 min。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验方案设计与结果(表2)

表2 响应面实验方案设计与结果

对回归模型方程进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析

2.2.2 响应面图和等高线图分析(图5)

由图5a可知，木瓜蛋白酶用量与脱蛋白温度的等高线的形状趋近于圆形，这说明两者之间的交互作用影响较小，相对而言，脱蛋白温度的曲线较为陡峭，其对蛋白脱除率的影响较大。由图5b可知，木瓜蛋白酶用量与脱蛋白时间的交互作用影响显著，且脱蛋白时间的轴向等高线较为密集，木瓜蛋白酶用量的轴向等高线相对稀疏，说明脱蛋白时间对蛋白脱除率的影响较大。由图5c可知，脱蛋白温度与脱蛋白时间的交互作用影响较小，且脱蛋白时间的轴向等高线较稀疏，而脱蛋白温度的轴向等高线较密，说明脱蛋白温度对蛋白脱除率的影响较大。对拟合得到的二次多项回归方程进行极值分析，两边取一阶偏导为零[18]，可知：X1=0.17、X2=0.373、X3=0.14，即预测地黄多糖脱蛋白的最优工艺条件为：木瓜蛋白酶用量1.043%、脱蛋白温度61.87 ℃、脱蛋白时间102.9 min，预测蛋白脱除率为68.87%。

图5 各因素交互作用对蛋白脱除率影响的响应面图和等高线图

2.2.3 工艺验证

考虑到工艺的可操作性，将模型预测得到的工艺条件微调为：木瓜蛋白酶用量1.05%、脱蛋白温度62.0 ℃、pH值7、脱蛋白时间103 min，在此条件下，进行了3组平行实验，地黄多糖的蛋白脱除率平均值为68.53%，多糖保留率为87.72%，与模型预测值接近。说明采用响应面法优化得到的工艺条件真实可靠。鉴于单纯木瓜蛋白酶法对地黄多糖的蛋白脱除率较低，为进一步降低地黄多糖的蛋白含量，又采用Sevage法对地黄多糖进行了2次脱蛋白处理，结果显示，地黄多糖的蛋白脱除率可达86.71%，多糖保留率为77.45%。说明，采用木瓜蛋白酶法结合Sevage法进行地黄多糖脱蛋白的工艺路线更加合理。

3 结论

以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化了地黄多糖的酶法脱蛋白工艺条件。确定了酶法脱蛋白的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶用量1.05%、脱蛋白温度62.0 ℃、pH值7、脱蛋白时间103 min，采用酶法结合2次Sevage法进行脱蛋白处理，地黄多糖的蛋白脱除率可达86.71%，多糖保留率为77.45%。木瓜蛋白酶法结合Sevage法是一种较好的地黄多糖脱蛋白方法，具有蛋白脱除率高、多糖保留率高、操作简单、污染较小等优点，为深入研究地黄多糖奠定了基础。