高碳基土壤修复肥对连作烟田土壤改良及烤烟生长发育的影响

杨立均，郝浩浩，许晓敬，吴俊林，鲁雅雯，金维环，郭红祥*

(1.河南省烟草公司 驻马店市公司，河南 驻马店 463000；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002)

近年来，随着我国耕地面积的逐年减少，为了提高农业总体生产力，大量的化肥被施入土壤，不仅导致土壤酸化、板结以及养分流失，而且还降低了肥料利用率，严重影响着农产品的品质[1-2]。因此，深入研究土壤改良机制，探索土壤综合治理措施，改善土壤理化性状，提高土壤的生产力，构建烟田健康和谐的土壤环境，是我国烟叶生产可持续发展的最终途径。生物质炭不仅可以降低土壤容重，提高土壤pH值、团聚性和持水能力，而且还可作为一种天然的氮素肥料缓释剂延缓肥料在土壤中的释放，降低养分淋失。高碳基土壤修复肥是一种高碳低氮肥料，主要由生物炭、有机载体、天然矿物质肥、腐殖酸、微量元素等成分组成，大量的研究表明，生物质炭与肥料混合施用，对作物的生长发育和产量均表现出正效应[3-6]。土壤、植物和肥料三者之间，既是互相关联，又是相互影响、相互制约的。科学施肥要充分考虑三者之间的相互关系，针对不同的土壤与作物进行合理施肥。不同的土壤养分对土壤微生物群落的影响非常大，继而影响土壤养分的利用和对土壤的改良[7-8]。因此，仍需针对特定土壤开展合理施用高碳基土壤修复肥的研究。驻马店市是河南省烤烟生产的主要地区之一，长期单一的烟草种植模式容易造成土壤质量退化，土壤中微生物区系平衡被破坏，作物病虫害滋生，影响烟草的正常生长发育，最终造成产量和品质降低。因此，本文选取河南驻马店烟区为试验区，通过土壤微生物群落变化、土壤酶、土壤养分和烟草生长发育的全面系统分析，评价了施用高碳基肥改良土壤的效果，形成了适合河南驻马店烟区的高碳基肥施用方案，可为烟田的可持续发展和合理施肥提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试烟草品种是中烟100。供试高碳基土壤修复肥来自河南惠农土质保育研发有限公司，其总养分(N+P2O5+K2O)≥5%、有机质(干基)≥45%、生物炭≥20%、粗脂肪≥1%、水分≤20%。供试重茬抗病肥(微生物菌肥)来自河南万亩康生物科技有限公司，其总养分(N+P2O5+K2O)≥5%、有机质≥45%。烟草专用肥(N 10%、P2O512%、K2O 18%)为市购。

1.2 试验设计

在驻马店烟区选择烟草连作3年以上的中低产烟田(pH 4.98，有机质11.9 g/kg，水解性氮77.4 mg/kg，有效磷11.6 mg/kg，速效钾175 mg/kg)，采用完全随机区组设计，共5个处理：CK，常规施肥(烟草专用肥750 kg/hm2，饼肥600 kg/hm2)；T1,常规施肥(减74.96 kg烟草专用肥/hm2)+高碳基土壤修复肥375 kg/hm2；T2,常规施肥(减149.92 kg 烟草专用肥/hm2)+高碳基土壤修复肥750 kg/hm2；T3,常规施肥(减209.89 kg 烟草专用肥/hm2)+高碳基土壤修复肥750 kg/hm2+重茬抗病肥298.5 kg/hm2；T4,常规施肥(减224.88 kg 烟草专用肥/hm2)+高碳基土壤修复肥1125 kg/hm2。每个处理0.013 hm2，每个处理重复3次。在大田旺长期，每个试验小区各随机选取6棵健康生长的烟株，测定烟株的农艺性状和光合指标；将烟株的根系完整挖出，去除根际外围土壤，轻轻将根部附着的土壤(4 mm内)揉捏抖动到封口袋中，放入冷藏箱运回实验室，除去杂根等后提取土壤DNA。剩余根际土壤用于理化性质的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 土壤微生物分析 提取土样总DNA后，进行PCR扩增，形成测序文库；先对建好的文库先进行文库质检，再对质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。对原始数据进行拼接(FLASH，version 1.2.11)，将拼接得到的序列进行质量过滤(Trimmomatic，version 0.33)，并去除嵌合体(UCHIME，version 8.1)，得到高质量的Tags 序列。使用QIIME(version 1.8.0)软件中的 UCLUST对Tags在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，并基于细菌的Silva 数据库(Release128，http://www.arb-silva.de)和真菌的Unite 数据库(Release 7.2， http://unite.ut.ee/index.php)对OTU进行分类学注释。利用Mothur(version v.1.30，http://www.mothur.org/)软件进行土壤微生物α 多样性分析，包括Chao1丰富度指数、Ace 丰富度指数、Shannon指数和Simpson指数。

1.3.2 烟株生长发育测定 在旺长期，采用便携式光合测定仪测定光合作用等指标，记录株高、茎围、叶长、叶宽、地上部与地下部的鲜重和干重。每个处理取6株，计算平均值。

1.3.3 土壤理化性质测定 土壤pH值用pH计进行测定，有机质含量用重铬酸钾法测定，可溶性氮、速效磷和速效钾含量测定由河南省农业科学院科学实验中心分析完成[9-10]；土壤酶活性分析采用关松荫的方法[11]。

1.3.4 基因表达检测 采用qPCR方法分析根系养分吸收相关基因的表达(表1)。用TRIzol法提取根系的总RNA，用TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) 合成cDNA。用TaKaRa SYBR_Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)试剂盒进行qPCR检测。每个反应体系包含2 μL稀释后的cDNA、正反引物各0.5 μL、12.5 μL 2×SYBR_Premix Ex TaqTMⅡ和9.5 μL水(nuclease-free)。反应程序如下：95 ℃ 30 s后，运行40个循环(95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，每个样品重复3次。将NtActin作为内参基因。引物序列见表1，用2-△△CT法计算表达量。

表1 基因表达检测引物

1.4 数据统计及分析

对收集的数据使用SPSS 20.0进行整理分析，不同处理间差异性分析采用Duncan’s多重比较进行，图表绘制使用Excel 2013完成。

2 结果与分析

2.1 高碳基土壤修复肥对土壤微生物多样性的影响

土壤微生物是土壤的重要组成部分，它对土壤肥力的形成和植物营养的转化起着积极的作用，土壤微生物种类、数量可以作为评价土壤肥力的指标[12-14]。表2显示了烟草旺长期土壤微生物群落和α多样性，各处理细菌的OTU数、香农-威纳指数、ACE指数和Chao1指数显著高于对照，表明施用高碳基土壤修复肥能够增加土壤细菌数量和种类。各处理真菌的OTU数、香农-威纳指数、ACE指数和Chao1指数显著低于对照，表明施用高碳基土壤修复肥能够减少土壤真菌数量和种类。

表2 土壤微生物群落与α多样性分析结果

从图1可以看出，烟草土壤细菌相对丰度较高的菌门有变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、 拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)和螺旋体门未知属(Saccharibacteria)，这10个菌群的总量占土壤整个细菌群落的95.5%以上。由于生活习性和生态适应性的差异，不同土壤细菌对高碳基土壤修复肥的响应也不同，施用高碳基土壤修复肥处理的酸杆菌门(Acidobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度大于CK，T2处理的酸杆菌门丰度最大，T1处理的芽单胞菌门丰度最大。放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度随着高碳基土壤修复肥施用量增加而减少。

从图2可以看出，在细菌属水平上相对丰度较高的有酸杆菌属(uncultured_bacterium_f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1])、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、待定放线菌门Gaiellales属(uncultured_bacterium_o_Gaiellales)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Candidatus_Solibacter、uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae、链霉菌属(Streptomyces)、亚硝化单胞菌属(uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae)、酸微菌属(uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales)。各处理鞘氨醇单胞菌属和链霉菌属的丰度均大于对照，酸杆菌属和Candidatus_Solibacter的丰度小于CK，表明高碳基土壤修复肥的施用可以增加鞘氨醇单胞菌属和链霉菌属的丰度，降低酸杆菌属和Candidatus_Solibacter的丰度。

A：Unclassified；B：uncultured_bacterium_f_Acidobacteriaceae_[Subgroup_1]；C：Sphingomonas；D：Candidatus_Solibacter；E：Gemmatimonas；F：uncultured_bacterium_o_Gaiellales；G： Streptomyces；H：uncultured_bacterium_f_Nitrosomonadaceae；I： uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae；J：uncultured_bacterium_o_Acidimicrobiales；K：Unknown。图1 高碳基土壤修复肥对土壤细菌门水平相对丰度的影响

图2 高碳基土壤修复肥对土壤细菌属水平相对丰度的影响

物种注释结果表明，所有处理真菌门水平相对丰度真菌菌群归为12个门类：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、毛霉亚门(Mucoromycota)、隐真菌门(Rozellomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、丝足虫类(Cercozoa)、捕虫霉门(Zoopagomycota)、梳霉门(Kickxellomycota)、Calcarisporiellomycota、Aphelidiomycota，其中子囊菌门和担子菌门真菌是优势菌(图3)。高碳基土壤修复肥能增加担子菌门的相对丰度，降低子囊菌门的相对丰度。

图3 高碳基土壤修复肥对土壤真菌门水平相对丰度的影响

图4显示相对丰度比较高的真菌属有中国斑褶菇属(Panaeolus)、裸盖菇属(Psilocybe)、小棒孢囊壳属(Corynascella)、被孢霉属(Mortierella)、链格孢属(Alternaria)、青霉属(Penicillium)、Guehomyces、Immersiella。与CK相比，所有处理的中国斑褶菇属和裸盖菇属相对丰度降低，而青霉属和小棒孢囊壳属的相对丰度增加。

图4 高碳基土壤修复肥对土壤真菌属水平相对丰度的影响

图5为各处理的土壤细菌COG功能预测分析结果，能源生产和转换、氨基酸转运和转换、碳水化合物运输、转录、细胞壁/膜合成、信号转导机制是最主要的功能，T2和T3处理的丰度明显高于对照和其他处理。

2.2 高碳基土壤修复肥对土壤酶和养分的影响

土壤酶活性与土壤微生物类群密切相关，土壤酶活性不仅能够反映土壤微生物群落的代谢状况，还可以作为评价土壤肥力高低、生态环境质量优劣的一个重要生物指标[15-16]。表3显示，T1、T2的脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性随着高碳基土壤修复肥施用量的增加而提高，T3处理的3种酶活性明显高于T2，说明在高碳基土壤修复肥施用量相同的情况下配施微生物肥能够进一步改良土壤，提高酶活性。T4的3种酶活性与T1、T2差异不显著，说明过多施用高碳基土壤修复肥会降低促进酶活的效率。

表3 高碳基土壤修复肥对土壤酶活性的影响

A：RNA加工和修饰；B：染色质结构和动力学；C：能源生产和转换；D：细胞周期控制、染色体分配；E：氨基酸转运和转换；F：核苷酸转运和代谢；G：碳水化合物运输；H：辅酶转运和代谢；I：脂质运输代谢；J：翻译,核糖体结构与合成；K：转录；L：复制、重组与修复；M：细胞壁/膜合成；N：细胞动力；O：翻译后修饰与加工；P：无机离子转运和代谢；Q：次级代谢；R：一般功能预测；S：未知功能；T：信号转导机制；U：细胞内分泌、运输与交换；V：防御机制；W：细胞外结构；Y：核结构；Z：细胞骨架。图5 高碳基土壤修复肥对土壤细菌功能丰度的影响

表4显示烟田土壤pH值范围为5.14～5.76，随着高碳基土壤修复肥施用量的增加，土壤根际土壤pH值逐渐增加，因此高碳基土壤修复肥可以用作酸性土壤的改良剂来中和土壤酸度，提高土壤的pH值。随着高碳基土壤修复肥施用量的增加，土壤根际土壤有机质、速效磷、有效钾和水解性氮含量逐渐增加，T3和T4处理间差异不显著，表明高碳基土壤修复肥能够有效改良土壤，提供土壤养分，但施用量过多会降低改良土壤的效率。

表4 高碳基土壤修复肥对土壤养分含量的影响

2.3 高碳基土壤修复肥对烟草生长发育的影响

2.3.1 高碳基土壤修复肥对烟株光合作用的影响 烟叶既是烟株的营养器官又是其经济器官，因此，个体与群体的光合作用决定着烟株的生长、发育和产量品质形成。N能增加叶面积和叶绿素含量，P、K能加速叶片内碳水化合物的转化，故施肥能提高光合作用。表5显示T3处理的光合速率最大，而T4处理的光合速率小于T2和T3，表明高碳基土壤修复肥施用量过大不利于光合作用，适当的高碳基土壤修复肥施用量和重茬抗病肥配合施用的效果最佳。

表5 高碳基土壤修复肥对烟株光合特性的影响

2.3.2 高碳基土壤修复肥对烟株生长发育的影响 根系是烟株吸收土壤中水分和养分以及合成生物碱的重要器官，其大小、分布及活力对烟株的生长发育及烟叶产量、品质有着很大的影响，施肥与土壤环境会影响根系的生长和分布[17]。表6显示T3处理烟株地下部和地上部的干重、干鲜比均最大，表明高碳基土壤修复肥和重茬抗病肥配合施用能够明显促进烟株的生长发育。

表6 高碳基土壤修复肥对烟株生长发育的影响

2.3.3 高碳基土壤修复肥对烤烟农艺性状的影响 表7显示了不同处理中烟株的生长性状，从中可以看出， T3处理的株高、茎围、叶长和叶宽均大于其它处理。T0、T1、T2、T3处理相比较发现，随着高碳基土壤修复肥施用量的增加，株高、茎围、叶长和叶宽等性状逐渐增大，但是T4处理的株高、茎围、叶长和叶宽小于T1、T2、T3，表明高碳基土壤修复肥施用量不宜过高。

表7 高碳基土壤修复肥对烟株农艺性状的影响

2.4 高碳基土壤修复肥对烤烟根系养分吸收相关基因表达的影响

根系-土壤微生物互作能够促进植物对养分的吸收。植物体内铵转运蛋白、离子转运蛋白、硝酸盐转运蛋白和磷酸盐转运蛋白调节着植物对N、P、K的吸收，维持它们在植物体内的稳定并使土壤中N、P、K得到高效利用。上述结果显示T3处理的烟株生长发育明显好于其他处理，因此进一步分析了T3和对照烟株根系养分吸收相关基因的表达情况。图6显示，T3处理的高亲和性铵转运蛋白、高亲和性钾离子转运蛋白、高亲和性硝酸盐转运蛋白和磷酸盐转运蛋白的表达明显高于对照，说明T3处理能够促进烟株对土壤N、P、K的吸收与利用。

ATM：高亲和性铵转运蛋白；HAK：高亲和性钾离子转运蛋白；NRT：高亲和性硝酸盐转运蛋白；PT：磷酸盐转运蛋白。图6 高碳基土壤修复肥对烤烟根系养分吸收相关基因表达的影响

3 讨论与结论

土壤微生物区系的恶化失调是烟草连作障碍发生的重要原因。生物炭能通过多种机制影响土壤细菌活性与数量。本研究发现，高碳基土壤修复肥能显著增加烟田土壤细菌的数量，降低真菌数量，这与黄瓜、水稻栽培上的结果类似[18-19]。生物质炭不仅能为土壤细菌提供更多的C源，其特殊的孔隙结构又为土壤细菌的生长提供良好的生境，增加了根际有益微生物数量，而这些有益菌对部分土壤病原真菌又有直接的拮抗作用，可减少真菌的数量[20-21]。

土壤pH影响着烟株对养分的吸收，生产优质烟叶的最适土壤pH是5.5～7.0。连作使得土壤严重酸化，根际土壤pH随着连作年限的增加而逐渐下降，连作6年时已低于最适范围。本研究表明高碳基土壤修复肥可以中和土壤酸度，提高土壤的pH值，同时也能提高土壤酶活性与养分，促进烟株生长发育。

近年来的研究表明，生物质炭能够通过改变土壤物理化学性质、增加土壤养分、改变根际土壤微生物群落结构、降解或抑制连作障碍有害物质的毒害效应、改变次生代谢产物的迁移，进而改善根系对土壤养分和水分的吸收、促进作物生长[22]。本研究结果显示，高碳基土壤修复肥能够促进烟株地下部和地上部的生长发育，尤其是高碳基土壤修复肥和重茬抗病肥配施效果更加显著，表现出协同效应。这一方面是由于高碳基土壤修复肥的促进作用；另一方面重茬抗病肥能够清除连作土壤积毒，抑杀土传病虫害，提高土壤肥料利用率，补充土壤养分，促进烟草生长发育。高碳基土壤修复肥和重茬抗病肥配施时，高碳基土壤修复肥含有的易分解的有机物质可以为重茬抗病肥中的微生物提供碳源和氮源，同时其含有的生物质炭的多孔隙结构能够为微生物提供附着位点和较大的生存空间。因此，两者配施可以发挥协同增效作用。

植物表型是基因表达调控的结果，既然高碳基土壤修复肥能够促进烟株的生长发育，其基因表达势必会发生改变。生物质炭不仅能够促进水稻叶片中蛋白质代谢相关基因的表达，也被发现能够提高番茄抗性基因的表达[23-24]。本研究发现高碳基土壤修复肥能够显著提高烟株根系养分吸收相关基因的表达，表明高碳基土壤修复肥促进了烟株对土壤N、P、K的吸收与利用。

综上所述，高碳基土壤修复肥和重茬抗病肥配施能够增加烤烟连作土壤中根际土壤细菌数量，降低根际真菌数量，改善土壤微生物群落结构，提高土壤pH和土壤酶活性，增加土壤养分含量，增加根系养分吸收相关基因的表达，提高养分吸收利用效率，促进烟株生长发育。