卧龙自然保护区野生动物肠道寄生虫感染情况调查

何廷美 ，陈善瑜，施小刚，柴宜均，陈礼颖，许佳雪，程跃鸿，彭广能*

（1.四川卧龙国家级自然保护区管理局，四川汶川 623006；2.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130）

四川卧龙自然保护区是国家级第三大自然保护区，珍稀动植物繁多，享有“熊猫之乡”“宝贵的生物基因库”“天然动植物园”等美名。保护区内国家一级重点保护野生动物有15种，二级重点保护野生动物有53 种［1］。越来越多的研究显示寄生虫病是危害野生动物的主要疾病之一［2］，某些人兽共患的寄生虫病还会给人类健康带来威胁。动物肠道内常见的寄生虫主要有绦虫、吸虫、线虫和原虫，以及一些虫体微小的原虫，如芽囊原虫（Blastocystis sp.）。近期有研究发现，珍稀野生动物在感染芽囊原虫过程中具有人畜共患的风险［2］。本研究调查了四川卧龙自然保护区内包括野生大熊猫、小熊猫、豹猫在内的12 种珍稀野生动物肠道寄生虫的感染情况，旨在丰富保护区野生动物肠道寄生虫感染的本底资料，同时做好潜在人兽共患病的风险评估。

1 调查对象

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）、小熊猫（Ailurus fulgens）、豹猫（Prionailurus bengalensis）、羚牛（Budorcas taxicolor）、猪獾（Arctonyx collaris）、藏酋猴（Macaca thibetana）、林麝（Moschus berezovskii）、豪猪（Hystrix hodgsoni）、中华鬣羚（Capricornissumatraensis）、毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）、中华斑羚（Naemorhedus griseus）、水鹿（Rusa unicolor）12种野生动物。

2 动物粪便样本的采集

2020 年4 月～5 月，四川卧龙自然保护区巡山工作人员在保护区内不同地理位置和海拔使用一次性自封袋采集动物粪便（粪便排出体外的时间控制在3 d以内），体型较大的大动物采集50～100 g 粪便，小动物采集10～20 g 粪便，编号记录动物种类、采集地区、采集时间，低温保存送四川农业大学实验室检查。

3 方法

3.1 主要溶液及配制方法

3.1.1 饱和食盐水 用电子秤称取500g NaCl置于320 mL蒸馏水中，然后缓慢加热使其完全溶解，冷却后装于500mL容量瓶中，4℃冰箱储存待用。

3.1.2 2.5%重铬酸钾溶液 先称取2.5 g K2Cr2O7，然后将其溶解于100 mL ddH2O 中，常温密闭保存。

3.1.3 1%琼脂糖凝胶 天平称取琼脂糖粉1.2 g，溶解于120 mL 1倍TBE溶液中，微波炉高火加热至沸腾后，小火加热至澄清，取出冷却至不烫手，滴加GoldView染液10 μL，用玻棒搅拌，并倒入制胶板中，冷却凝固后置于电泳槽中备用。

3.2 虫卵检查方法

3.2.1 饱和盐水漂浮法 取被检粪便10 g 左右，放入100 mL烧杯内，加饱和盐水至40 mL，将粪便搅碎、充分混匀，经分样筛过滤，将滤液倒入2 mL离心管中，使液面凸出瓶口呈半球形，静置30min，用载玻片刚好触碰到液面（以蘸取漂浮在液面上的虫卵），然后盖上盖玻片，置显微镜下检查。

3.2.2 沉淀法 取备检粪便10 g 左右，放入烧杯内，加入清水至40 mL，将粪便搅碎、充分混匀，经分样筛过滤，将滤液倒入烧杯中，静置30 min，倒去上清液，如此反复操作3～4 次，最后弃上层液体取沉淀物涂布于载玻片上，盖上盖玻片，置显微镜下检查。

3.2.3 虫卵鉴定 根据检出虫卵、卵囊的颜色、形态、大小等特征，参考相关专业书籍、文献进行分类、鉴定［3-5］。

3.3 粪便基因组DNA 的提取 每份粪便取200～300 mg置于2 mL离心管中，加入蒸馏水，混匀，12 000 r/min离心1 min，弃上清，重复上述步骤直至清洗干净表面的重铬酸钾得到清亮透明的液体。随后按照E.Z.N.A.®Stool DNA Kit粪便全基因组提取试剂盒（Omega Biotek Inc D4015-01，USA）说明书的操作步骤提取DNA，操作完成后将DNA放于-20 ℃冰箱中待检。

3.4 PCR 扩增及测序 基于芽囊原虫SSU rRNA基因位点对所提取的DNA 样品进行PCR 扩增。根据文献［6］给出的引物和NCBI中的基因序列来设置引物、反应条件与反应体系。

3.4.1 引物 所需合成的引物序列及产物DNA片段大小见表1。

表1 芽囊原虫PCR引物

3.4.2 反应体系 PCR扩增反应体系为25 μL，见表2。

表2 PCR反应体系

PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；93 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72 ℃再延伸3 min；10 ℃永久保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生工生物技术有限公司进行单向测序。

3.5 SSU rRNA序列分析及种系发育分析 测序后的序列在NCBI 的Blast 上进行相似性比对，将所获得的序列与GenBank 上同源性最高的序列进行比较，确定序列是否是芽囊原虫的基因组，分析序列差异确定亚型。利用Mega7.0 软件，选择邻接法（Neighbor-joining，NJ 法）中的Kimura-2-parameter模型，构建系统发育树。进化树的可靠性用Bootstrap分析进行检测，进行1000个重复。

4 调查结果

4.1 野生动物肠道寄生虫感染率 75 份粪便样品经饱和食盐水漂浮法、沉淀法和分子生物学方法检测，结果有36份粪便样品的寄生虫检测呈阳性，总感染率为48.0%。感染的寄生虫有线虫、绦虫、芽囊原虫、吸虫、螨虫、球虫、滴虫。其中阳性率最高的是线虫30.7%（23/75），其次是绦虫13.3%（10/75）、芽囊原虫12.0%（9/75）、吸虫8.0%（6/75）、螨虫4.0%（3/75）、球虫1.3%（1/75）、滴虫1.3%（1/75）。单纯感染占总感染数的44.4%（16/36）。12 种野生动物中除了豪猪、猪獾外其余10种动物都不同程度地感染了寄生虫，水鹿、毛冠鹿、豹猫感染较为严重。各种动物肠道寄生虫感染率和寄生虫种类见表3。

表3 卧龙自然保护区野生动物寄生虫感染情况

4.2 粪便中芽囊原虫SSU rRNA 基因的PCR扩增结果 75 份野生动物粪便样品中，扩增出9份约为600 bp 的阳性样品，测序结果显示这9 份样品均是芽囊原虫阳性样品，总感染率为12.0%（9/75），阳性样品分别来源于3 份水鹿、3 份中华斑羚、1份毛冠鹿、1份中华鬣羚和1份林麝，表明这些野生动物都感染了芽囊原虫。

4.3 芽囊原虫SSU rRNA 的序列分析及亚型分布 测序成功的序列在Blast上进行相似性比对，结果显示有9 个芽囊原虫阳性样品，9 个阳性样品被归为5 个不同的序列，上传至NCBI 数据库，获得的登录号为MT764942～MT764946。

基于SSU rRNA基因序列构建的进化树（图1）显示，本次获得的9 个芽囊原虫阳性分离株处于5个不同的分支，这与上述归类结果一致。3份水鹿芽囊原虫样品中，1 份属于ST5 亚型，2 份为ST14。其他芽囊原虫样品中，中华斑羚3 份阳性样品分别属于ST1、ST5、ST13 亚型，毛冠鹿源为ST13亚型，中华鬣羚源为ST14亚型，林麝源是芽囊原虫属。

图1 基于SSU rRNA基因片段的芽囊原虫亚型NJ系统分析

5 讨论

本次调查发现，四川卧龙自然保护区野生动物的肠道寄生虫感染率为48.0%，感染率低于福建地区的圈养野生动物（60.0%，24/70）［2］，唐山市野生动物园（55.6%，40/72）［7］，贵州某动物园野生动物（52.0%，13/25）［1］，高于之前徐贤东报道的某动物园野生动物（43.2%，216/500）［8］。这可能是由于圈养野生动物比野外野生动物密度大、饲养环境差导致的，也可能是动物园长期使用同一种驱虫药使寄生虫产生了耐药性所致，不同的地理位置、海拔、气候也是影响寄生虫感染率的一个重要因素。寄生虫病是危害野外野生动物的主要疾病之一，故应定期监测和评估野生动物寄生虫感染情况，制定相关防控方案。

据笔者所知，本次是我国第一个关于水鹿和毛冠鹿感染芽囊原虫的报道。这些亚型中，ST1、ST5 为人兽共患亚型，其中ST1 在非人类灵长类中感染最多，ST14为动物特异性亚型。芽囊原虫是世界范围内感染人和动物最常见的肠道寄生虫之一［9］。芽囊原虫通常通过囊泡污染的水和食物经粪口途径传播，这是传播的主要方式［10］。先前的研究表明，芽囊原虫与肠应激综合征（IBS）和炎症性肠病（IBD）有关［11］。然而，没有研究能够证实囊胚是IBS或IBD的唯一病因［12-13］。在本研究中，芽囊原虫的患病率为12%，与最近对驯鹿（6.7%）、猪（8.8%）、牛（9.5%）、家鸡（13.0%）、丹顶鹤（14.0%）的研究结果相似［14-15］，可见芽囊原虫的感染与否与是否是野生动物不存在显著的相关性。

6 调查结论

本调查结果显示，保护区内的野生动物感染肠道寄生虫较为普遍，其中线虫和绦虫感染最常见，这可能是因为该寄生虫生活史简单、易反复感染导致的。保护区内野生动物繁多，分布广泛，全部进行免疫驱虫较难实现，但可以对野生动物进行定期的寄生虫抽查，将感染率控制在安全红线以下，特别是人畜共患寄生虫更应该进行密切监测。对于保护区内病死或老死的动物尸体，应妥善处理、查清病因，以免发生疫病传播。

致谢：感谢四川农业大学动物医学院实验室给予的支持和帮助以及陈福浩、樊佳琦、罗静怡在样本处理及镜检过程中所做出的贡献！