不同临床病理特征非小细胞肺癌中miR-1269 的表达及其对细胞周期的靶向调控作用

詹莉琼，卢晏民，崔杰

作者单位：商丘市第一人民医院，a呼吸与危重症医学科，b肿瘤三科，河南 商丘476000

肺癌的发病率和死亡率在世界范围内位居首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的病理类型，我国NSCLC 的发病率也呈成年升高的趋势，但早期诊断率并不高、多数病人就诊时已达中晚期并错过了最佳治疗时机［1-2］。虽然近年来分子靶向药物的不断问世使NSCLC 病人的生存情况得到改善，但病人的长期生存率仍较低，亟需探寻新的治疗靶点。miR-1269 是具有促癌特性的miR，已经在肝癌细胞和肺癌细胞中被证实能够靶向抑癌基因FOXO1的表达，进而促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭［3-4］。FOXO1在NSCLC 的发生发展过程中起到抑癌作用，能够靶向抑制细胞周期蛋白（Cyclin）D1的表达、增加细胞周期负性调控分子p21Cip1、p27Kip1的表达，进而使细胞周期发生停滞［5-7］。但是，miR-1269 在NSCLC 病灶内的变化及其与细胞周期的调控作用均未明确。为此，本研究具体分析了不同病理特征非小细胞肺癌中miR-1269 的表达及其对细胞周期的靶向调控作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年3月至2018年12月商丘市第一人民医院手术切除的NSCLC 病灶和对应的癌旁病灶 58 例，其中男性 32 例、女性 26 例，年龄（51.31±8.42）岁，年龄范围为41～64 岁。入组标准：（1）经术后病理诊断为NSCLC；（2）临床资料完整；（3）术前未接受过放化疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 细胞及试剂 miRNA 提取试剂盒、miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒购自北京天根公司，肺癌A549细胞株购自中科院上海细胞资源中心，miR-1269的模拟物和抑制物购自上海吉玛公司，蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的单克隆抗体购自Abcam公司。

1.3 仪器 光定量PCR 仪购自Bio-rad 公司，细胞培养箱和高速离心机购自Thermo公司，倒置显微镜购自Nikon公司，凝胶成像仪购自上海天能公司。

1.4 miR-1269表达量的检测 取NSCLC病灶和癌旁病灶，采用miRNA 提取试剂盒进行操作、提取组织中的miRNA，采用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒进行操作、将miRNA反转录为cDNA；采用miRNA荧光定量PCR 检测试剂盒配置应该定量PCR 反应体系，对 cDNA 中的 miR-1269 及 U6 进行扩增，根据扩增循环曲线及循环阈值、以U6为内参、计算miR-1269的表达量。

1.5 细胞培养及分组 A549细胞用含有10%胎牛血清的DMEM在培养瓶中贴壁培养，细胞铺满底面90%后用0.125%的胰蛋白酶进行消化传代，得到足够数量的细胞后接种在培养板中并进行分组处理。空白对照组用DMEM 处理，NC 模拟物组转染NC 模拟物、miR-1269模拟物组转染miR-1269模拟物、NC抑制物组转染NC 抑制物、miR-1269 抑制物组转染miR-1269抑制物。

1.6 细胞周期蛋白表达的检测 采用蛋白裂解液提取NSCLC病灶、癌旁病灶、转染后A549细胞中的蛋白，经BCA试剂盒测定总蛋白含量后取30～50µg总蛋白进行检测，将蛋白样本加入预先配置好的聚丙烯酰胺凝胶中，电泳后将凝胶中的蛋白样本电转移至NC 膜，用5%脱脂牛奶在室温封闭NC 膜2 h，洗膜3 遍后用 CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的单克隆抗体在4 ℃孵育NC膜过夜；第二天，洗膜3遍后用第二抗体在室温孵育NC 膜2 h，最后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，根据条带灰度值计算蛋白表达量

1.7 统计学方法 采用SPSS20.0 软件录入数据。两组间计量资料的比较采用t检验，配对组间比较行配对t检验，多组间比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同病理特征非小细胞肺癌中miR-1269表达的变化 SCLC病灶中miR-1269的表达量明显高于癌旁病灶（P＜0.05）；低未分化NSCLC 病灶中miR-1269 的表达量明显高于高中分化NSCLC 病灶（P＜0.05）；有淋巴结转移的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表达量明显高于无淋巴结转移的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有脉管浸润的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表达量明显高于无脉管浸润的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有胸膜侵犯的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表达量明显高于无胸膜侵犯的NSCLC 病灶（P＜0.05）。见表1。

表1 不同病理特征非小细胞肺癌（NSCLC）中miR-1269表达的变化

2.2 肺癌中细胞周期蛋白表达的变化及其与miR-1269 的相关性 NSCLC 病灶中 CyclinD1、CDK4、CDK6的表达量明显高于癌旁病灶，p21Cip1、p27Kip1的表达量明显低于癌旁病灶（P＜0.05）；NSCLC病灶中miR-1269 的表达量与 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表达量呈正相关，与p21Cip1、p27Kip1的表达量呈负相关。见图1、表2。

表2 非小细胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶内细胞周期蛋白表达的比较/

表2 非小细胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶内细胞周期蛋白表达的比较/

注：配对t检验，CyclinD1为细胞周期蛋白D1

p21Cip1p27Kip1例数58 58组织来源癌旁NSCLC t 值P 值CyclinD1 0.58±0.10 0.31±0.07 15.527 0.000 CDK4 1.09±0.22 0.52±0.07 17.037 0.000 CDK6 0.73±0.16 0.25±0.05 22.318 0.000 0.52±0.08 0.70±0.13 8.282 0.000 0.58±0.09 0.85±0.15 6.895 0.000

图1 非小细胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶内细胞周期蛋白的条带图 图2 空白对照组、NC模拟物、miR-1269模拟物组细胞周期蛋白的条带图 图3 空白对照组、NC抑制物组、miR-1269抑制物细胞周期蛋白的条带图

2.3 miR-1269 模拟物和抑制物对A549 细胞中细胞周期蛋白表达的调节 miR1269 模拟物组A549细胞中CyclinD1、CDK4、CDK6的表达量明显高于空白对照组、NC 模拟物组，p21Cip1、p27Kip1的表达量明显低于空白对照组、NC 模拟物组（P＜0.05）；miR1269 抑制物组 A549 细胞中 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表达量明显低于空白对照组、NC 抑制物组，p21Cip1、p27Kip1的表达量明显高于空白对照组、NC抑制物组（P＜0.05）。见图2，3；表3，4。

3 讨论

miR-1269是具有促癌特性的miR-1269，已经被证实在肝癌病人外周血及肝癌病灶内均呈高表达的趋势［8-9］；另有细胞实验证实，miR-1269对肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭具有促进作用［4］。在本研究中，NSCLC 病灶内miR-1269 的表达量明显升高，结合miR-1269在体外促进癌细胞增殖、迁移、侵袭的活性分析认为，miR-1269的高表达与NSCLC的发生有关且病灶内高表达的miR-1269 能够通过改变癌细胞的生物学行为来促进肿瘤病理进程的发展。本研究进一步对不同病理特征NSCLC 病灶内miR-1269 表达量的变化进行了分析，低未分化、有淋巴结转移、有脉管浸润、有胸膜侵犯的NSCLC病灶中miR-1269的表达量明显升高，说明NSCLC 病灶内高表达的miR-1269能够使肿瘤病理特征发生恶化，分化程度明显降低且发生淋巴结转移、脉管浸润、胸膜侵犯。

表3 miR-1269模拟物对A549细胞中细胞周期蛋白表达的调节（n=5，）

表3 miR-1269模拟物对A549细胞中细胞周期蛋白表达的调节（n=5，）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与NC模拟物组比较，bP＜0.05，CyclinD1为细胞周期蛋白D1

组别空白对照组NC 模拟物组miR-1269 模拟物组F 值P 值p27Kip1 0.66±0.13 0.71±0.12 0.32±0.05ab 19.985 0.000 CyclinD1 0.48±0.06 0.51±0.07 0.77±0.15ab 12.306 0.001 CDK4 0.85±0.14 0.89±0.15 1.21±0.19ab 8.157 0.006 CDK6 0.50±0.07 0.48±0.05 0.71±0.09ab 15.710 0.001 p21Cip1 0.73±0.14 0.77±0.08 0.45±0.05ab 16.000 0.000

表4 miR-1269抑制物对A549细胞中细胞周期蛋白表达的调节（n=5，）

表4 miR-1269抑制物对A549细胞中细胞周期蛋白表达的调节（n=5，）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与NC模拟物组比较，bP＜0.05，CyclinD1为细胞周期蛋白D1

组别空白对照组NC 抑制物组miR-1269 抑制物组F 值P 值p27Kip1 0.71±0.13 0.73±0.11 1.13±0.18ab 13.713 0.001 CyclinD1 0.71±0.12 0.77±0.11 0.32±0.05ab 30.879 0.000 CDK4 0.80±0.12 0.83±0.14 0.33±0.07ab 30.321 0.000 CDK6 0.73±0.12 0.79±0.13 0.41±0.08ab 16.605 0.000 p21Cip1 0.33±0.05 0.36±0.07 0.84±0.14ab 45.500 0.000

miRs 是一类不具备编码蛋白质功能的小分子RNA，通过结合靶基因mRNA 来使mRNA 降解或阻碍mRNA 翻译，进而改变靶基因表达水平并产生相应的生物学效应［10-11］。FOXO1 是 miR-1269 的靶基因之一，该基因参与细胞周期的调控，一方面通过抑制cyclinD1 的表达并阻碍cyclinD1 与CDK4、CDK6的结合来使细胞周期停滞［12-13］，另一方面增加p21Cip1、p27Kip1的表达并增强两种分子对细胞周期的阻碍作用，两方面共同起效并实现对细胞周期的抑制［14-15］。在本研究中，细胞周期正性调控分子cyclinD1、CDK4、CDK6在NSCLC病灶内表达增多且与miR-1269 呈负相关，而细胞周期负性调控分子p21Cip1、p27Kip1在 NSCLC 病灶内表达减少且与 miR-1269呈正相关，说明细胞周期蛋白在NSCLC病灶内发生显著变化且这一变化可能受到miR-1269 的调控，miR-1269 通过靶向抑制FOXO1 的表达来削弱FOXO1对细胞周期蛋白的调控作用，进而使NSCLC病灶内细胞周期蛋白的表达发生变化。

为了进一步验证miR-1269 在NSCLC 病灶内对cyclinD1、CDK4、CDK6 及 p21Cip1、p27Kip1等细胞周期蛋白的调控作用，本研究在以上临床样本研究的基础上设计了细胞实验，在培养肺癌细胞A549 后将miR-1269的模拟物和抑制物转染进入细胞，分别实现miR-1269生物学效应的增强及抑制，通过分析模拟物和抑制物对细胞周期蛋白表达的影响来反应miR-1269对细胞周期表达的调控作用。在转染miR-1269模拟物后，A549细胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表达明显增多，而p21Cip1、p27Kip1的表达明显减少；在转染miR-1269 抑制物后，A549 细胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表达明显减少，而p21Cip1、p27Kip1的表达明显增多。以上细胞实验的研究表明，miR-1269能够靶向调控肺癌细胞中多种细胞周期蛋白的表达，使细胞周期正性调控分子cyclinD1、CDK4、CDK6 的表达增多，而细胞周期负性调控分子p21Cip1、p27Kip1的表达减少。

综上所述，miR-1269在NSCLC中呈显著高表达趋势且高表达的miR-1269 与NSCLC 病理特征的变化、细胞周期蛋白表达的变化均密切相关；miR-1269 能够在体外细胞中靶向调节多种细胞周期蛋白的表达。今后可进一步设计NSCLC荷瘤小鼠，抑制miR-1269表达后观察肿瘤的生长情况，进而探究抑制miR-1269在NSCLC治疗中的潜在价值。