异丙酚预处理通过上调Caveolin-3 增加缺血心肌细胞线粒体膜稳定性的机制研究

田香，邓德传，兰运辉，杨坤渹

作者单位：1湖北民族大学附属民大医院麻醉科，湖北 恩施 445000；2巴东县民族医院，湖北 恩施 444324

心肌缺血损伤是围手术期发病率和死亡率的主要原因［1］。在目前可用的干预措施中，药理学方法仍然是挽救受损心脏组织的有效替代方法［2］。作为一种广泛使用的静脉麻醉剂，异丙酚已被证明对心肌缺血损伤的心肌细胞具有保护作用［13］。尽管已经提出了几种假设来解释其心脏保护作用，但到目前为止，确切的机制还没有完全阐明，因为它们是多因素的和复杂的。除了改善氧化应激和维持线粒体功能外，PI3K/Akt通路通常被认为与异丙酚诱导的心脏保护作用有关［4］。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）产生的增加是心肌缺血损伤的关键事件之一［5］。过量的ROS产生导致线粒体损伤，包括线粒体膜电位的损失，并导致细胞凋亡［6］。因此，抑制ROS产生和保护线粒体免受氧化损伤是改善心肌缺血损伤的有效策略［7］。Caveolin-3，一种内源性分子和细胞膜穴样内陷的主要结构蛋白，据报道具有心脏保护作用［8-9］。Caveolin-3在心脏保护中的作用可见于Caveolin-3基因敲除小鼠中药理学预处理的抗性升高，以及具有心脏特异性Caveolin-3过表达的小鼠中细胞凋亡的减少［10-11］。此外，Caveolin-3具有许多支架结构域锚定多种信号分子如G蛋白，PI3K等，Caveolin-3也可作为 PI3K/Akt 的支架蛋白［12］。Caveolin-3 已被证实在挥发性麻醉药和阿片类药物引起的心脏保护中发挥了重要作用［13］。然而Caveolin-3是否参与心肌缺血期间异丙酚诱导的心肌保护及其潜在机制没有报道。本研究自2019年8—12月检查异丙酚是否通过上调Caveolin-3降低心肌缺血病人线粒体膜稳定性。

1 资料与方法

1.1 实验动物 筛选健康SD 大鼠36 只，体质量范围为250～300 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。本研究动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 分组 36只大鼠采用随机数字表法分为3组，每组12 只。①正常心肌细胞组：仅开胸不结扎；②心肌缺血再灌注组：单纯给予以5%葡萄糖稀释的脂肪乳，持续静脉滴注；③缺血心肌细胞+异丙酚预处理组：缺血前10 min开始持续静脉滴注异丙酚12 mg·kg-1·h-1，异丙酚用5%葡萄糖稀释。

1.3 心肌缺血再灌注造模 麻醉开胸，在动脉下穿3-0 的丝线，其末端套直径2 mm、长2 cm 的聚乙烯管，拉紧丝线以阻断冠脉血流，心脏表面青紫。松开丝线，即可恢复血流，心脏表面明显充血。缺血30 min，再灌注2 h。

1.4 心肌细胞制备 在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1 mm3的小块，加2～3 滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75 mL培养瓶底壁上。

1.5 制备全细胞提取物及蛋白质印迹分析 将心肌细胞用冷PBS 洗涤2 次并浸入裂解缓冲液（上海碧云天公司）（组合物：50 mmol/L HEPES，pH 7.4，0.1%Chaps，5 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA 和0.1%Triton X-100）中。离心细胞裂解物。通过Bradford Protein Assay Kit（上海碧云天公司）测定上清液中的蛋白质浓度。将等量样品上样并通过12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（上海碧云天公司）电泳分离。通过电泳转移系统将蛋白质转移到尼龙膜上。将膜在5%脱脂乳中在室温下封闭1 h。与第一抗体一起孵育在4 ℃开始过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联第二抗体2 h。用ChemiDocXRS 显现免疫印迹，并用LabImage软件分析。

1.6 测量细胞内ROS 通过荧光探针DCFH-DA（美国Sigma公司）测定ROS产生。细胞可渗透的非荧光DCFH-DA在ROS存在下氧化成高度荧光的2，7-二氯荧光素。将心肌细胞铺板在六孔板上，进行心肌缺血处理。通过胰蛋白酶消化收获细胞。在2次PBS 洗涤后，在37 ℃在黑暗中加入10 µmol/L DCFH-DA（上海碧云天公司）20 min。通过流式细胞术在488 nm 的激发波长和525 nm 的发射波长下测量荧光强度。

1.7 线粒体膜电位的测量 通过阳离子染料JC-1（上海碧云天公司）评估线粒体膜电位。在正常细胞中，JC-1 在线粒体中聚集，发红色荧光。在凋亡细胞中，JC-1在胞质溶胶（美国Sigma公司）中累积，作为绿色荧光单体。在实验结束时，通过胰蛋白酶消化收获1×106个细胞。在两次PBS 洗涤后，将细胞与 JC-110 µg/mL 在 37 ℃在黑暗中温育15 min。收获细胞，悬浮于PBS中，并通过流式细胞术分析。

1.8 心肌细胞凋亡 通过半胱天冬酶（caspase）比色测定试剂盒（上海碧云天公司）测定心肌细胞caspase-3和caspase-9活性。将心肌组织在冰冷的裂解缓冲液中匀浆30 s。将匀浆物离心。收集上清液，通过二辛可宁酸法测量蛋白质浓度。向96 孔板的每个孔中加载含有200 µg 蛋白质的上清液，并在37 ℃下与25 µg caspase-3 和caspase-9 底物N-乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺（上海碧云天公司）一起温育1.5 h。用SpectraMax-Plus 微孔板分光光度计在405 nm 下测量光密度。使用标准曲线计算caspase-3和caspase-9活性，并表示为相对于对照的平均值的倍数增加。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计分析软件进行处理。计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异丙酚上调Caveolin-3 水平 蛋白质印迹实验显示，心肌缺血再灌注组Caveolin-3蛋白降低，异丙酚改善心肌缺血诱导的Caveolin-3 下调（P＜0.05）。见图1，表1。

2.2 流式细胞术检测ROS 的产生 通过流式细胞术确定DCF 荧光强度来评估细胞内ROS 水平。心肌缺血再灌注组DCF 荧光增加（P＜0.05）。缺血心肌细胞+异丙酚预处理组心肌细胞DCF 荧光降低（P＜0.05）。见表1。

图1 Caveolin-3蛋白质印迹实验

2.3 异丙酚增加线粒体膜电位，并减少细胞色素C释放 线粒体膜电位是线粒体凋亡途径的重要早期决定因素。我们研究了异丙酚对线粒体膜电位和细胞色素C释放的影响。利用JC-1染料进行线粒体膜电位检测以评估线粒体膜去极化。与对照相比，经受心肌缺血的心肌细胞显示出线粒体去极化降低（P＜0.05）。缺血心肌细胞+异丙酚预处理组稳定了线粒体膜电位（P＜0.05）。线粒体去极化释放几种凋亡蛋白，细胞色素C 进入胞质溶胶。蛋白质印迹分析表明心肌缺血增加线粒体细胞色素C释放到胞质溶胶中，缺血心肌细胞+异丙酚预处理组降低细胞色素C释放（P＜0.05）。见表1。

2.4 异丙酚降低心肌缺血病人caspase-3和caspase-9活性 细胞凋亡是短时间缺血后立即再灌注后细胞死亡的主要机制，caspase-3和caspase-9活性是心肌细胞凋亡的非常特异的指标。心肌缺血再灌注组显示出 caspase-3 和 caspase-9 活性增加（P＜0.05）。与心肌缺血再灌注组相比，异丙酚降低了caspase-3和caspase-9活性（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

证据表明，Caveolin-3 可以缓解心肌缺血损伤。例如，诱导心肌细胞中Caveolin-3的特异性过表达模拟缺血诱导的心肌保护作用，而心脏Caveolin-3敲除消除了异丙酚的心脏保护作用［14］。在本研究中，我们发现Caveolin-3对异丙酚相关的心脏保护也很重要。异丙酚不仅可以保护心脏免受心肌缺血的损伤，还可以防止心肌缺血病人Caveolin-3下降。

鉴于失调的蛋白质降解可能导致心肌缺血损伤中蛋白质水平的变化，我们猜测蛋白酶体途径是否是心肌缺血诱导的Caveolin-3 蛋白质下调的原因。我们观察到心肌缺血中Caveolin-3 表达降低，异丙酚处理Caveolin-3表达升高。这些结果表明蛋白酶体途径可能在心肌缺血损伤下Caveolin-3下调中起作用。异丙酚在心肌缺血下维持Caveolin-3蛋白水平的作用可能有助于其对蛋白酶体途径相关的Caveolin-3降解的抑制作用。蛋白酶体普遍存在于哺乳动物细胞中，并且是主要的非溶酶体蛋白酶复合物，其负责大多数细胞内短寿命蛋白质的降解［15］。蛋白酶体在心脏心肌缺血损伤中的作用是一个新兴的领域。心脏心肌缺血引起蛋白酶体失能，这是特异性而非全局性的，关键抗氧化基因的蛋白酶体激活基本上不受影响。另一方面，泛素-蛋白酶体系统的药理学阻断赋予心肌缺血损伤的心脏保护作用，即在一定条件下，增强心肌抗氧化防御，减轻炎症，增加自噬反应。

表1 三组大鼠Caveolin-3蛋白、DCF荧光强度、线粒体膜电位、细胞色素C、caspase-3和caspase-9活性比较/

表1 三组大鼠Caveolin-3蛋白、DCF荧光强度、线粒体膜电位、细胞色素C、caspase-3和caspase-9活性比较/

注：与正常心肌细胞组比较，aP＜0.05；与心肌缺血再灌注组比较，bP＜0.05

caspase-9/U 0.84±0.06 2.25±0.21ab 0.93±0.11a 16.125 0.006组别正常心肌细胞组心肌缺血再灌注组缺血心肌细胞+异丙酚预处理组F值P值鼠数12 12 12 Caveolin-3 2.24±0.25 0.57±0.09ab 2.02±0.14a 13.274 0.013荧光强度1.00±0.12 2.79±0.21ab 1.23±0.14a 15.347 0.005线粒体膜电位1.00±0.06 0.13±0.02ab 0.83±0.11a 16.532 0.014细胞色素C 1.00±0.08 2.76±0.24ab 1.37±0.18a 12.195 0.025 caspase-3/U 1.23±0.14 3.46±0.21ab 1.47±0.13a 15.384 0.008

在生理条件下，自由基生成与内源性抗氧化系统之间存在着重要的平衡。诸如缺血和再灌注的病理状况倾向平衡，有利于ROS 过量产生，增加氧化应激，主要的凋亡刺激。抑制ROS 形成或拮抗ROS 毒性的药物对再灌注损伤的心肌具有保护作用。在目前的研究和许多其他研究中，心肌缺血损伤引起梗死和心功能不全。异丙酚减弱了经受心肌缺血的细胞损伤。

心肌细胞凋亡是心肌缺血损伤的主要致病机制之一。有证据表明，与再灌注毒性有关的ROS可通过线粒体凋亡途径引发心肌细胞凋亡［16］。在心肌再灌注早期释放的ROS强烈氧化已经被缺血损伤的心肌细胞。心肌细胞富含线粒体，这是一种主要的内源性来源，也是ROS损伤的易感靶点。线粒体介导的细胞凋亡在心肌缺血损伤发病机制中起重要作用。在正常条件下，细胞色素C位于线粒体内。在细胞内ROS过量产生期间，线粒体膜电位的崩溃导致线粒体通透性转换孔开放，并且快速释放细胞色素C进入细胞质。一旦释放，细胞色素C结合凋亡蛋白酶激活因子-1（Apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）的C 末端结构域，诱导构象变化。活化的Apaf-1/细胞色素C复合物促进caspase活化。半胱天冬酶转导并执行凋亡信号传导。caspase-3（末端常见的凋亡途径）也被激活，caspase-9被线粒体介导的凋亡途径激活。在目前的研究中，我们证明异丙酚预处理减轻了心肌缺血诱导的细胞内ROS，线粒体膜电位和细胞色素C线粒体释放到胞质溶胶中，表明线粒体途径参与异丙酚介导的心脏保护作用。

综上所述，我们的研究表明异丙酚在心肌缺血下的保护作用取决于Caveolin-3 的上调，后者降低活性氧产生、增加线粒体膜电位、减少细胞凋亡和细胞色素C释放。