怀菊花及其茎叶脂溶性成分GC-MS分析及其抗氧化活性研究

李 孟 张靖柯 石静亚 汤迎迎 孙彦君

1.河南中医药大学药学院，河南郑州 450046；2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南郑州 450046

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）为菊科植物菊的干燥头状花序，始载于《神农本草经》，列为上品。其味甘、苦，性微寒，主归肺、肝经，具有疏散风热、平肝明目、清热解毒的功效[1-2]。菊花作为我国传统的一味中药材，种类繁多，分布广泛，具有很高的药用价值。菊花在药用和保健方面都有很好的效果，是我国卫生部发布的第一批药食两用药材。目前国内对菊花的应用研究较多，对菊花茎叶的综合利用研究相关报道较少，大量菊花茎叶因其药用保健价值未能充分开发利用而遭丢弃。

2015版《中华人民共和国药典》新增“怀菊花”这一品种，与“亳菊”“滁菊”“贡菊”“杭菊”共同作为“菊花”入药，肯定了怀菊的药用地位。文献研究表明，怀菊花及其茎叶均含有以单萜类和倍半萜类及其含氧衍生物为主的挥发油类成分、黄酮类成分等[3-4]。为了全面探究怀菊花及其茎叶的化学成分，本研究采用索氏提取法提取其脂溶性成分，并运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法对其脂溶性成分组成进行鉴定分析，同时采用清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力的方法测定其脂溶性成分的抗氧化活性，以期为怀菊花整株资源的综合有效利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent7890/7000B三重串联四级杆气质联用仪（美国安捷伦公司）；BT-25S型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；AB204-N型万分之一电子天平（德国梅特勒公司）；索氏提取器（南京金正玻璃仪器厂）；调温试电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；N1100VWD型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）。分析纯石油醚（沸程60～90℃）、甲醇、正己烷无水硫酸钠、三氟化硼均为分析纯。

1.2 材料

菊花及其茎叶采自河南焦作，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的花和茎叶，晾干，待用。

2 方法

2.1 样品制备

取1.2项下的样品，粉碎成粗粉备用。称取各样品10g，以石油醚为溶剂，80℃索氏提取6h，提取液减压浓缩，得提取物，菊花为浅黄色油状物，菊花茎叶为浅绿色油状提取物。加入0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液，60℃恒温水浴30min，冷却后加入三氟化硼甲醇溶液5mL，于60℃水浴，加热回流5min，冷却，加正己烷和饱和氯化钠水溶液各2mL，取上清液加无水Na2SO4干燥，取样分析。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 气相色谱条件 色谱柱为HP-FFAP型石英毛细管柱（30mm×0.25mm，0.25μm），载气为高纯氦气（99.999%），氦气流速1.0mL/min；进样口温度为240℃；分流；升温程序为80℃保持2min，按10℃/min升温至190℃，保持2min，以2℃/min升温至230℃，保持15min，气化室温度为280℃，接口温度为240℃。

2.2.2 质谱条件 离子源：电子轰击源，电子能量70eV；扫描范围m/z30～600AMU，离子源温度230℃，溶剂延迟：4.5min，GC-MS接口温度240℃。

2.3 数据处理

用NIST98系统谱库自动检索组分的质谱，结合有关文献，分别与八峰索引、EPA/NIH相对照，匹配度均在80%以上。化合物的定量使用HewlettPackard软件按峰面积归一化法计算相对含量[5]。

2.4 DPPH法测定抗氧化能力

采用清除自由基的方法测定脂溶性成分的抗氧化能力[6]：DPPH自由基清除活性测定采用96孔板法，不同浓度的样品液及维生素C各取100μL放置于96孔板中，再添加100μL DPPH自由基溶液，在室温中反应30min后采用酶标仪测定其在517nm处的吸光度值。清除率的计算公式为：

清除率=[（A0-Ai）/A0]×100%

其中，A0表示空白组吸光度，Ai为样品组的吸光度，所有测定操作重复3次，取平均值。

3 结果

3.1 怀菊花及其茎叶脂溶性成分种类比较分析

依照上述条件对怀菊花及其茎叶的脂溶性成分进行分析，得出的总离子流图见图1，其脂溶性成分分析结果见表1。从怀菊花和怀菊茎叶中共鉴定出69个脂溶性成分，其中怀菊花鉴定出56个成分，检出成分相对含量占91.19%；怀菊茎叶鉴定出37个成分，检出成分相对含量占85.10%。

怀菊花的脂溶性成分主要有脂肪酸类（45.70%）、烷烃类（24.10%）、萜类（15.41%）以及少量的醇类、醛类、酮类等，主要成分（相对含量＞5.00%）有棕榈酸甲酯（10.41%）、肉豆蔻酸甲酯（7.85%）、二十一烷（9.32%）、二十五烷（6.66%）、亚油酸甲酯（6.57%）；怀菊茎叶的脂溶性成分主要是脂肪酸类成分（76.87%）以及少量的萜类等，其中不饱和脂肪酸占怀菊茎叶脂溶性成分的44.15%，饱和

脂肪酸占怀菊茎叶脂溶性成分的32.72%，主要成分（相对含量＞5%）为亚麻酸甲酯（29.16%）、棕榈酸甲酯（18.47%）和亚油酸甲酯（11.68%）。由此看出，怀菊花和其茎叶的脂溶性成分差异较大。而怀菊花和茎叶的脂溶性成分，共有峰是24个，分别占其相对含量的50.56%和81.78%，说明其脂溶性成分同时也具有一定的相似性。

表1 怀菊花及其茎叶脂溶性成分GC-MS分析

续表

表2 怀菊花及其茎叶脂溶性成分对DPPH自由基清除能力（%）

3.2 怀菊花及其茎叶脂溶性成分抗氧化活性研究

清除DPPH自由基能力的试验结果提示，怀菊花和茎叶脂溶性成分对DPPH有一定的清除作用，且随着浓度的增加，清除率也随之上升，有明显的量效关系，见表2，其对DPPH自由基的半数清除率IC50分别为9.76mg/mL和7.96mg/mL。

从怀菊花和怀菊茎叶中，共鉴定出69个脂溶性成分，共有成分24种，怀菊花的脂溶性成分主要为脂肪酸类、烷烃类和萜类，怀菊茎叶主要是脂肪酸类。活性结果提示，其脂溶性成分具有一定的抗氧化活性。

4 讨论

菊花始载于《神农本草经》，列为上品，具有疏散风热、平肝明目、清热解毒的功效。现代药理学研究表明，菊花具有改善心肌营养、去除活性氧自由基、加强毛细血管的抵抗力、降低血液中脂肪和胆固醇的含量、抑制肿瘤、延缓衰老及增强人体免疫力等功效。怀菊花作为“四大怀药”之一，主产于河南武陟、温县地区，种植的历史较悠久，为河南道地药材[7]。课题组前期对怀菊花的化学成分进行了研究，从中得到了一系列愈创木烷型倍半萜内酯类、黄酮类、糖苷类等化合物[8-10]，刘晓薇等[11]对怀菊花的挥发性成分进行研究，发现怀菊花中的挥发性成分主要为单萜类和倍半萜类及其含氧衍生物。目前对菊花茎叶化学成分的研究主要集中在挥发油[12]、黄酮类、酚酸类及多糖类成分等方面，研究和开发利用相对较少，其资源的处置多为弃去或做饲料用，造成环境污染和资源浪费。

本研究采用GC-MS对怀菊花和其茎叶的脂溶性成分进行分析，从怀菊花和怀菊茎叶中共鉴定出69个脂溶性成分，怀菊花鉴定出56个，怀菊茎叶鉴定出37个，共有成分24个，分别占其相对含量的50.56%和81.78%。怀菊花的主要成分是棕榈酸、肉豆蔻酸、二十一烷、二十五烷、亚油酸等；怀菊茎叶的主要成分是亚麻酸（29.16%）、棕榈酸（18.47%）、亚油酸（11.68%）等。亚麻酸作为人体必需脂肪酸，只能通过食物摄取，是合成前列腺素的前体，参与脂肪代谢，与视力、脑发育和行为发育有关；棕榈油酸对肥胖症、糖尿病和脂肪肝等具有一定的疗效，且对伤口发炎具有抑制效果以及改善皮肤光滑度等[13]；亚油酸是人体自身不能合成但必需的不饱和脂肪酸，具有降低血脂、防止动脉粥样硬化及预防脂肪肝、抑制血栓形成的功效[14]。另外，怀菊花中鉴定出单萜和倍半萜类化合物20余种（15.41%）、烷烃类7个（24.1%），这是与怀菊茎叶的主要差异成分，说明两者的脂溶性成分具有一定的差异性。

刘东顺等[15]对菊花、叶、茎的水提物和醇提物抗氧化活性的研究表明，菊花、叶和茎提取物均有较强的抗氧化活性，菊叶抗氧化作用与菊花相当。本研究采用DPPH法测定怀菊花和茎叶脂溶性成分的抗氧化能力，结果提示，怀菊花和茎叶的脂溶性成分均具有抗氧化活性。本研究从化学成分的角度，进一步说明怀菊茎叶作为天然抗氧化剂有较好的开发利用价值，为怀菊资源的充分利用提供科学依据。