多胺氧化酶抑制剂对草莓果实成熟的影响

莫翱玮，沈元月

(农业应用新技术北京市重点实验室/北京农学院 植物科学技术学院，北京 102206)

草莓属于非呼吸跃变型果实，具有生长周期短、可以连续坐果，果实供应周期长等特点，因此是研究果实发育的理想材料。草莓不耐储运，研究其成熟调控的生理机制具有重要的产业价值。

多胺(polyamines，PAs)是一类广泛存在于原核及真核生物中的低分子量脂肪族胺[1-2]，具有一定的生物活性[3,4]。游离形式的二胺腐胺(putrescine，Put)、三胺亚精胺(spermidine，Spd)和四胺精胺(spermine，Spm)是高等植物中多胺的主要成分，参与调节植物多种生理过程，如胚胎发育、开花，果实发育和成熟衰老，也参与植物体对生物和非生物胁迫的反应[5-9]。植物中PAs分解代谢主要在植物胺氧化酶作用下进行。目前已知的胺氧化酶包括二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)。PAO抑制剂可以降低多胺的分解代谢，Guazatine，N3-Prenylagmatine (G3)和N,N‘-Bis(2,3- butadienyl)-l,4-butane-diamin(MDL72527)作为PAO主要抑制剂，可以抑止PAO活性的64%～75%，在研究PAO的功能方面发挥重要作用[10-11]。Agudelo-Romero等发现多胺分解代谢可能在葡萄果实成熟中发挥调节作用[12]。Tsaniklidis等在番茄研究中发现，果实PAO基因在随着果实发育阶段表达量逐渐升高，特别是在红果期，表达量远远高于绿果期，这表明多胺分解代谢的增强可能在果实成熟中起作用[13]。

目前，关于PAs在参与草莓果实成熟及品质形成方面已经取得了一些重要进展，通过操纵FaSAMDC的表达，达到抑制或加速Spd和Spm的生物合成，进而调控草莓果实的发育和成熟，该研究的主要方向是多胺合成与果实发育和成熟的关系[14]。但是，与SAMDC调控果实成熟过程Spd和Spm的生物合成相反，PAO参与的Spd和Spm降解在草莓果实中作用有待研究。

为了揭示PAO在草莓果实成熟中的作用，本研究以‘章姬’草莓为材料，使用一定浓度的PAO抑制剂对发育中草莓果实进行外源涂抹处理，研究PAO在草莓果实成熟中调控作用，为草莓果实的成熟调控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

使用北京农学院东大地温室栽培的‘章姬’(‘ZhangJi’)草莓品种。条件控制为：温度17～26 ℃、相对湿度70%～90%、光照/黑暗14/10 h。选取40个草莓单株的120朵花，并对其进行花期标记。记录在果实发育的七个时期的状态，包括小绿果期、大绿果期、褪绿果期、白果期、始红期、片红期和全红期。

1.2 试验方法

1.2.1 草莓果实的外源抑制剂处理 参考Agudelo-Romero以及王伟[10,15]用外源PAO抑制剂处理葡萄果实和拟南芥的方法，选用浓度为100 μM的Guazatine、N3-Prenylagmatine(G3)、N,N‘-Bis(2,3- butadienyl)-l,4-butane-diamin(MDL72527)溶液，用脱脂棉签均匀地涂抹在褪绿时期果实的表面，同时用无菌水作为对照，经过8 d后去瘦果(种子)，切取花托(果实，0.5～0.8 cm3)并立刻液氮速冻，-80 ℃保存待用，样本量10个果，试验重复3次。

1.2.2 花色苷的测定 参照农业标准NY/T 3164—2017提取花色苷，用高效液相色谱检测，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.2%甲酸溶液-乙腈(98∶2)混合溶液，流动相流量为1 mL/min，色谱柱温度为30 ℃，每个样品进样量为10 μL，检测波长520 nm[16]，样本量3个果，重复3次。

1.2.3 果实硬度的测定 草莓切去果皮，果实硬度计力度均匀插进果实读数，样本量3个果，重复3次。

1.2.4 可溶性糖的测定 参照国标GB 5009.8—2016处理样品，用高效液相色谱检测，色谱柱为Sugar-PakTM1 column (6.5 mm×300 mm, Waters)，超纯水做流动相，流动相流量为0.4 mL/min，柱温60 ℃，进样量20 μL，检测温度为50 ℃，用示差折光检测器(RID)检测数值，样本量3个果，试验重复3次。

1.2.5 多胺含量的测定 参照GB/T 21970—2008进行样品的配制及多胺衍生，用高效液相色谱检测，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 um)，柱温30 ℃，流动相为甲醇-水(64∶36)，流速0.7 mL/min，检测波长230 nm，进样量为10 μL，样本量3个果，试验重复3次。

1.2.6 RNA提取及反转录 RNA提取参照OMEGA R6827-01 试剂盒说明书，反转录cDNA按照北京全式金生物公司TransScript© First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书。

1.2.7 荧光定量(qRT-PCR)分析基因表达量 荧光定量PCR反应体系参照北京全式金公司TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒说明，PCR 反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延30 s，45个循环。草莓FaPAO5基因和内参基因Actin[17]荧光定量引物如下：FaPAO5-F：5′-GTGCTACTTCAACTTCTTC-3′，FaPAO5-R：5′-CTAAACCCCAACATGGTGG-3′；FaAC TIN-F：5′-GCCAACCGTGAGAAGAT-3′，FaACTIN-R：5′-TCCAGAGTCAAGAACA-3′。实时荧光定量PCR仪(Roche Light Cycler 96，瑞士)上机结束后，通过LC96软件分析试验数据，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 草莓果实的发育过程

‘章姬’(‘ZhangJi’)草莓从花后到成熟需要近30 d，在17 d左右果实发育至褪绿时期，褪绿后的果实开始软化并着色，之后果实体积快速增大并快速着色(图1)。

2.2 PAO抑制剂处理对草莓成熟的影响

如图2所示，8 d后，观察果实表型，并统计各处理下深红色、红色和浅红色果实的比例。结果表明，试验组主要为深红色，而对照组果实主要为浅红色。与对照组相比，抑制剂处理后果实的多胺氧化酶基因(FaPAO5)表达量显著降低、花色苷含量增加、可溶性糖含量上升、果实硬度降低及 Put含量降低，Spm和Spd含量升高。以上结果表明，多胺氧化酶PAO在草莓果实成熟中发挥着重要作用。

(A)抑制剂处理表型；(B)不同处理后果实颜色统计；数据使用Duncan检测法进行方差分析，*表示统计学显着性差异(P <0.05)

3 讨 论

草莓被认为是研究非呼吸跃变型果实发育的模式植物材料，并且草莓果实成熟及品质形成过程中伴随着多胺的合成与分解，果实硬度改变，可溶性固形物的不断积累，可溶性糖(葡萄糖、果糖及蔗糖)及花色苷积累等复杂变化[18]。通过外施多胺氧化酶抑制剂Guazatine、G3、MDL72527处理草莓果实，发现果实FaPAO5基因表达量下降，对应果实的硬度降低，可溶性糖、花色苷含量升高，因此初步推断PAO参与草莓果实的成熟。

多胺广泛存在于植物体内，对提高植物抗逆性，调控植物发育、果实发育与成熟起着十分重要的作用，而PAO可以氧化分解多胺产生H2O2和1,3-二氨基丙烷(1,3-diaminopropane，Dap)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，对维持植物体内多胺水平至关重要[19-20]。通过抑制PAO活性，多胺氧化酶可能作为一种阻遏蛋白，抑制FaPAO5基因表达，致使基因表达量下降，达到负调控目的。而果实内Put含量降低，Spd和Spm却上升，因此推测多胺氧化酶参与了多胺的末端分解代谢。Put降低可能是果实内Spd和Spm分解减缓，而 Put 作为Spd和Spm 上游合成底物其含量也会相应减少。Spd和Spm含量增加，与之前试验中，多胺合成途径的关键酶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)调控果实内Spd 和 Spm量，达到参与调控草莓果实的成熟结果相一致[14]，最终推测多胺氧化酶通过调节草莓果实内多胺水平(主要是Spd和Spm水平)参与调控草莓果实的成熟。