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麝香乌龙丸对人脐静脉内皮细胞的细胞连接及RhoA/ROCK信号通路的影响

2020-11-20梅晓峰王志文马炜秀张凯淇侯淋飞曹颖

风湿病与关节炎 2020年10期
关键词:类风湿关节炎

梅晓峰 王志文 马炜秀 张凯淇 侯淋飞 曹颖

【摘 要】目的:观察麝香乌龙丸对高浓度1-磷酸鞘胺醇(S1P)诱导下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞连接及RhoA/RhoA激酶(ROCK)信号通路的影响,探讨麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎的作用机制。方法:将HUVEC分为4组:对照组,高浓度S1P组,高浓度S1P + 麝香乌龙丸组,高浓度S1P + S1PR2拮抗剂JTE013组。采用免疫荧光检测HUVEC中细胞连接相关蛋白ROCK、ZO-1的变化,Western blot检测RhoA、ROCK、磷酸化RhoA激酶(p-ROCK)、ZO-1蛋白的表達水平。结果:高浓度S1P干预后,HUVEC中RhoA、p-ROCK、ROCK蛋白表达均上调,ZO-1表达下调,与对照组比较,差异有统计学意义

(P < 0.05)。麝香乌龙丸能够下调RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白的表达,上调ZO-1表达,与高浓度S1P组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:麝香乌龙丸能够通过RhoA/ROCK通路调控HUVEC细胞连接相关蛋白ROCK、p-ROCK及ZO-1的表达,稳定HUVEC的血管屏障,这可能是麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎的机制之一。

【关键词】 关节炎,类风湿;麝香乌龙丸;人脐静脉内皮细胞;S1P细胞连接蛋白;RhoA/ROCK信号通路

【ABSTRACT】Objective:To observe the effect of Shexiang Wulong Wan(麝香乌龙丸,SXWLW)on the cell junction and RhoA/ROCK signal pathway of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)induced by high concentration of sphingosine 1-phosphosphingol(S1P),and to explore the mechanism of SXWLW in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods:HUVEC was divided into four groups:the control group,the high-concentration S1P group(the HS1P group),the high concentration S1P + SXWLW group(the HS1P + SXWLW group),and the high concentration S1P + S1PR2 antagonist JTE013 group(the HS1P + JET013 group).Immunofluorescence was used to detect the changes of cell junction related proteins ROCK and ZO-1 in HUVEC.The expression levels of RhoA,ROCK,phosphorylated RhoA kinase(p-ROCK)and ZO-1 were detected by Western blot.Results:Under the intervention of high concentration of S1P,the expressions of RhoA,p-ROCK and ROCK in HUVEC were up-regulated and ZO-1 was down regulated,the difference was statistically significant compared with the control group(P < 0.05).

SXWLW could down regulate the expression of RhoA,ROCK,p-ROCK protein,and up regulate the expression of ZO-1,and the difference was statistically significant com-pared with the HS1P group(P < 0.05).Conclusion:SXWLW can regulate the expressions of ROCK,p-ROCK and ZO-1 and stabilize the vascular barrier of HUVEC through RhoA/ROCK pathway,which may be one of the mechanisms of SXWLW in treating rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis,rheumatoid;Shexiang Wulong Wan(麝香乌龙丸);HUVEC;S1P cell junction related proteins;RhoA/ROCK signaling pathway

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性、侵袭性关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病。主要病理改变为滑膜组织中多种炎性细胞及炎性因子浸润,滑膜新生血管生成,软骨损害以及骨破坏,最终导致关节畸形甚至残疾。RA血管翳中新生血管结构不成熟,内皮细胞类似高内皮静脉,排列不整齐,血管通透性增加,导致血液中炎性细胞穿出血管进入滑膜组织,从而加重了滑膜炎症,不断侵蚀软骨及骨组织[1-3]。由此可见,高通透性新生血管网的存在是导致滑膜持续炎症及软骨损害的重要原因。如果能够改善新生血管的屏障功能,将可能减少滑膜组织的炎症状态。稳定的细胞连接是保证血管结构完整的必要条件。血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)及闭锁小带蛋白1(ZO-1)分别是粘附连接和紧密连接中的关键蛋白,其表达及定位与1-磷酸鞘胺醇(S1P)的细胞外浓度密切相关[4]。

S1P是RA血管生成的一个强有力的诱导因子[5]。

S1P作为细胞内的第二信使以及细胞外刺激与特定的G蛋白偶联受体S1P受体(S1PR)结合发挥生物学效应。RA患者滑液中的S1P水平明显高于非炎性骨关节炎患者[6]。高浓度S1P与血管内皮细胞表面的S1PR2结合,诱导VE-cadherin处于分散状态,减弱细胞连接,具体细节尚不清楚[7];

高浓度S1P还可激活RhoA,通过下游效应分子ROCK促进应力纤维形成,加强细胞收缩[8];同时还能通过RhoA途径使ZO-1蛋白解体,破坏紧密连接[9]。本课题组前期研究表明,麝香乌龙丸能显著抑制滑膜组织血管生成,有效抑制滑膜炎症,减少关节软骨基质的降解[10]。麝香乌龙丸是否能够通过加强新生血管细胞连接改善血管屏障功能,起到治疗RA的作用呢?通过研究麝香乌龙丸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)S1P-RhoA/ROCK信号通路及下游细胞连接相关蛋白ZO-1、ROCK的影响,探讨麝香乌龙丸治疗RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 HUVEC(上海中乔新舟生物科技有限公司,货号ZQ 0113);麝香乌龙丸(由人工麝香、制川乌、地龙、全蝎、黑豆组成,华北理工大学附属医院提供,批号冀药制字Z20051581);SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,P1200-1);JTE013抑制剂(Cayman,383150-41);ZO-1抗体(美国GeneTex公司,GTX108592),RhoA抗体(arigo公司,ARG66306);兔抗β肌动蛋白、兔抗磷-ROCK1(北京博奥森生物技术有限公司,bs-0061R、bs-4630R);辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司,ZB-2301)。

1.2 实验方法

1.2.1 麝香乌龙丸水提物制作 将麝香乌龙丸放入超微粉碎机粉碎,取粉10 g加10 mL纯水,常温浸泡过夜,然后超声80 Hz,37 ℃,30 min,离心机以20 000 r·min-1离心20 min,离心半径21 cm,取上清液,冷冻干燥成粉,取50 mg冻干粉,加入纯水至5 mL,制成浓度为10 mg·mL-1的母液,0.22 μm滤器过滤后使用。

1.2.2 细胞培养及分组 HUVEC培养在含有1640 + 10% FBS培养基中,放入细胞培养箱(37℃、5%CO2)进行孵育,待细胞生长接近融合,生长面积达85%~95%时可消化并传代。该实验使用4~7代细胞。细胞分4组:①对照组:含10% FBS的1640培养基,培养24 h;②高浓度S1P组(S1P组):含10% FBS的1640培养基,24 h后倒掉原培养基,PBS洗3遍,加入含10 μmol·L-1 S1P培养基,刺激30 min;③高浓度S1P组 + 麝香乌龙丸(S1P + SXWLW组):浓度为320 μg·mL-1麝香乌龙丸提取物 + 10% FBS的1640培养基,24 h后倒掉原培养基,PBS洗3遍,加入含10 μmol·L-1 S1P培养基,刺激30 min;④S1P + S1PR2拮抗剂JTE013组(S1P + JTE013组):加入含1 μmol·L-1 S1PR2拮抗剂JTE013 + 10% FBS的1640培养基,24 h后倒掉原培养基,PBS洗3遍,加入含10 μmol·L-1 S1P培养基,刺激30 min。

1.2.3 CCK-8法检测细胞活性 将HUVEC以每孔5000个接种于96孔板中,含10% FBS的1640培养基预培养24 h;倒掉培养基,加入100 μL浓度分别为20,40,80,160,320 μg·mL-1的麝香乌龙丸提取液,培养24 h。每孔加入10 μL CCK溶液,继续培养4 h,测定在450 nm处的吸光度值。

1.2.4 免疫荧光染色 将HUVEC接种于培养皿的中心玻璃小孔中,待细胞融合至70%~80%,按实验分组设计处理细胞,然后放入4%多聚甲醛,固定细胞30 min,水化15 min,用山羊血清封闭30 min,PBS清洗3遍,每次2~3 min,擦干。分别加入一抗ZO-1(1∶100)、p-ROCK(1∶200),每孔20 μL,4 ℃过夜。PBS洗3次,加入FTC标记的山羊抗兔二抗(1∶500),每孔20 μL,37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3次,DAPI染核,荧光显微镜观察,激发光波长488处采集图像。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western blot)检测 按上述分组处理细胞后,RIPA裂解,离心取上清,BCA法进行蛋白定量。常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,加入相应一抗ZO-1、ROCK、p-ROCK及RhoA浓度均为1∶1000,4 ℃过夜。二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶1000),室温孵育1 h。ECL显色,Image J软件分析,计算蛋白条带灰度值,目的蛋白表达水平用目的蛋白与内参蛋白的灰度比值表示。

1.3 統计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示,组间比较选择单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK-8检测麝香乌龙丸提取物对HUVEC细胞增殖的影响 20 μg·mL-1麝香乌龙丸提取液促进HUVEC细胞增殖,80 μg·mL-1及其以上浓度抑制细胞增殖,当药物浓度为320 μg·mL-1时,抑制率为30.85%,选择该浓度作为后续实验药物浓度。见表1。

2.2 免疫荧光法检测ZO-1蛋白表达 对照组中,ZO-1蛋白主要集中表达在细胞膜上。S1P组细胞膜ZO-1蛋白表达减少,部分分散于胞浆中。S1P + SXWLW组及S1P + JTE013组细胞膜ZO-1蛋白表达较S1P组增多,但少于对照组。见图1。

2.3 免疫荧光法检测p-ROCK蛋白表达 对照组中,p-ROCK蛋白表达较少,主要分布在胞浆以及胞核周围;S1P组p-ROCK蛋白的表达上调,集中分布在胞浆以及胞核;S1P + SXWLW组及S1P +  JTE013组中p-ROCK蛋白表达减少。见图2。

2.4 Western Blot检测ROCK、p-ROCK、RhoA、ZO-1蛋白表达 与对照组比较,S1P组细胞ZO-1蛋白表达降低(P < 0.05),RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白表达升高(P < 0.05)。与S1P组比较,S1P + SXWLW组和S1P + JTE013组ZO-1蛋白表达增加(P < 0.05),RhoA、ROCK、p-ROCK蛋白表达下降(P < 0.05)。见表2、图3。

3 讨 论

RA滑膜组织中血管翳形成的基础是滑膜中新生血管,影响新生血管的因素有血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子1(HIF-1)、血管生成素、趋化因子及其受体、促炎性细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)与黏附分子等[11]。目前滑膜血管翳的血管新生是RA研究中的热点。新生血管翳为滑膜提供养分,通過抑制血管新生可以有效阻止RA进展。同时,新生血管结构不成熟,屏障功能减弱是造成炎性细胞的原因之一;细胞连接不紧密,可以促进血管内皮细胞迁移,是新血管生成的基础。因此,稳定的细胞连接对减少炎性细胞浸润及血管新生都很重要[12-13]。细胞连接主要包括粘附连接和紧密连接2种,内皮细胞间接触由2种类型的连接复合物介导:粘附连接(AJs)和紧密连接(TJs)。VE-cadherin及ZO-1分别是粘附连接和紧密连接中的关键蛋白,在血管稳定性和血管完整性方面发挥着重要作用。他们的表达及定位与S1P的细胞外浓度密切相关[14]。

S1P是一种存在于血浆中的多效信号脂质分子,S1P在调节包括细胞增殖、迁移、炎症介质合成、血管生成和血管成熟在内的多种生理和病理过程中起到关键作用。重要的是,细胞外S1P可与5种不同的G蛋白偶联受体(GPCRs)结合,称为S1PR1-5,其中3种受体(S1PR1、S1PR2和S1PR3)在内皮细胞(ECs)中表达。正常关节腔滑膜液中S1P生理浓度为10~600 nmol·L-1,这一浓度范围的S1P主要激活受体S1PR1,可维持血管稳定和增强屏障功能[15],而S1PR2和S1PR3均与内皮细胞破坏有关[16]。受体亚型表达的平衡以及血浆S1P浓度水平决定了血管的完整性。RA患者滑液中的S1P处于高水平状态,滑膜液中S1P浓度可达(17.51±4.23)μmol·L-1[17]。高浓度S1P与血管内皮细胞表面的S1PR2结合,通过激活RhoA和下游激酶ROCK,引起p-ROCK分布的改变,并减少内皮细胞表面ZO-1蛋白表达,从而破坏紧密连接,降低内皮细胞的屏障功能[18]。以上证据表明高浓度S1P将损害血管屏障功能,这一过程与S1PR2活化,激活RhoA/ROCK信号通路密切相关。可见,RA滑膜液中高浓度的S1P是导致滑膜血管翳新生以及新生微血管结构异常的重要原因。减少高浓度S1P对滑膜血管屏障的破坏,也许能够减少炎细胞浸润,血管新生,从而改善滑膜炎症。

RA属中医学“痹证”“历节病”范畴,经络痹阻为其基本病机,故RA亦属于中医学的“络病”范畴,治疗应以祛邪通络为主。麝香乌龙丸源自许叔微《普济本事方》的麝香圆,经药物和剂量调整研制而成。方中麝香为君药,通诸窍,开经络,透肌骨;制川乌为臣药,祛风除湿,温经止痛,现代药理学研究表明乌头碱具有显著的抗炎镇痛作用,治疗RA具有显著疗效[19];地龙善通经络,全蝎息风解痉止痛,两者相伍搜剔络道,攻剔深入经络、筋骨、肌肉之邪,共为佐药,并引川乌直达病所;黑豆补益肝肾,并解诸药之毒为使药。诸药配伍,在温阳通络的同时,兼有祛风除湿,化瘀止痛,补肾强骨之功。该药在临床使用20余年,治疗RA取得了良好疗效[20-21]。

现代中医基础理论研究认为,络病与血管生成相关病变关系密切[5],并在很多疾病的研究中得到证实。RA被认为是一种“血管生成性疾病”,抗血管新生治疗是RA的研究热点[6]。本研究结果表明膜液中高浓度S1P导致内皮细胞连接破坏,与高浓度S1P活化S1PR2,激活RhoA/ROCK信号通路,损害微血管内皮细胞之间的细胞连接密切相关;麝香乌龙丸可以通过干预S1PR2-RhoA/ROCK信号通路,维持微血管屏障。这也许是麝香乌龙丸抑制血管新生,减轻滑膜炎症治疗RA的机制之一。

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收稿日期:2020-01-28;修回日期:2020-04-14

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