再生基因4（RegⅣ）的原核表达、蛋白结构复性及纯化

徐杨张学良杜惠芬柴丹丹连晓雯张瑞君李克生

1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州730050；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州750050

再生基因4（regenerating geneⅣ，RegⅣ）为钙依赖性凝集素（c型凝集素）超家族的一员，是一种小分子分泌性蛋白质，分子量约为18.2KD，由158个氨基酸构成，包括22个氨基酸的信号肽和一个C型植物凝集素识别结构域［1，2］。RegⅣ蛋白在消化道肿瘤、生殖系统及其他系统肿瘤以及溃疡和炎性组织中呈高表达［3-5］，在正常胃肠道及胰腺中的表达水平非常低；其异常表达能够显著促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和迁移，抵抗凋亡，并可提高肿瘤细胞对化疗药物和放射线的耐受水平［6，7］。本研究团队前期对胃癌中RegⅣ和SOX9的调控关系进行了研究，发现Reg IV可能通过调控SOX9的表达水平参与胃癌细胞的侵袭和迁移［8］。可见，RegⅣ在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。本研究在大肠埃希菌系统中构建携带目的基因的原核表达质粒，诱导表达人RegⅣ全长重组蛋白，并对表达的包涵体蛋白进行结构复性、纯化，为制备RegⅣ单抗及开发新型的RegⅣ抗癌靶向治疗药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）购自Merck公司；pET-30a表达载体为中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠；DNA Marker，蛋白质Marker，限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ，T4 DNA连接酶购自Takara公司；异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），纯化试剂盒，质粒提取试剂盒购自大连宝生物公司；本研究所用其他相关试剂均为国产分析纯；pEGFP-C1-RegIV质粒由本实验室前期试验构建保存（酶切位点为KpnⅠ/BamHⅠ）。

1.2 构建pET-30a-RegIV重组质粒 将本实验室前期构建保存的序列正确的pEGFP-C1-RegIV质粒［8］和pET-30a表达载体分别用KpnⅠ和BamHⅠ进行双酶切，用DNA纯化试剂盒分别进行纯化，然后将纯化的目的片段和pET-30a空载体置于16℃水浴中连接过夜，取连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，在LB平板（含50μg/mL卡那霉素）铺板后37℃恒温培养箱培养过夜，标记并挑取单个菌落，以此做模板用pET-30a载体通用引物T7/T7terminator进行PCR扩增。待反应结束后，取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR鉴定为阳性的克隆菌落过夜培养，提取质粒，进行双酶切（KpnⅠ/BamHⅠ）鉴定，取1mL菌液送苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定，鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a-RegIV，将pET-30a-RegIV质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，在LB平板（含50μg/mL卡那霉素）铺板后37℃恒温培养箱培养过夜。

1.3 RegIV基因的诱导表达 将pET-30a-RegIV/BL21（DE3）重组菌加入到5mL LB培养基（含卡那霉素50μg/mL），37℃，200r/min过夜培养。次日将过夜培养的菌液按1∶50转接至新鲜培养基中（含卡那霉素50μg/mL），继续培养至OD600为0.6～1.0，取出1mL未诱导菌液做阴性对照，余者加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，200r/min诱导培养4h后，4℃5500r/min离心10min，收集菌体，按1g/10mL向菌体沉淀中加入TE缓冲液，充分混匀，反复冻融3次，冰浴超声破碎至溶液透明，4℃12000r/min离心15min，收集上清。向沉淀中加入适量2mol/L的尿素溶液，悬浮沉淀，4℃静置5min，4℃12000r/min离心15min，收集上清。最后加入8mol/L的尿素溶液4℃振摇过夜，使沉淀完全溶解。分别将上清样品、尿素溶液溶解的沉淀样品及阴性对照品处理后进行SDS-PAGE分析。

1.4 重组人RegIV蛋白的复性纯化 取诱导表达的沉淀物以8 mol/L的尿素溶液溶解，以尿素溶液梯度递减方式复性，用Sephacryl S-400凝胶层析柱纯化，收集主蛋白峰，获得目的蛋白，进行SDS-PAGE分析。

2 结果

2.1 重组表达质粒的构建及鉴定pET-30a-RegIV/DH5α菌落PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500～1000之间的片段，目的片段加上表达载体上的核苷酸序列理论值为814 bp，因此选取2号与7号菌液提取质粒。见图1。质粒pET-30a-RegIV的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500bp的目的片段，与理论值一致（477 bp）以及约5400bp的载体片段。见图2。阳性克隆测序结果表明，重组质粒构建成功，目的基因片段与靶基因（序列号：NM_001159352.2）一致。见图3。共编码RegIV含信号肽序列的158个氨基酸残基。加上表达载体上的38个氨基酸残基，重组质粒pET-30a-RegIV表达的重组蛋白共196个氨基酸残基，N末端具有His标签，分子量理论值约为22KD。

2.2 重组人RegIV蛋白的表达、复性及纯化 选取7号质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，诱导表达前后的样品经SDS-PAGE分析显示，构建的工程表达菌pET-30a-RegIV/BL21（DE3）经IPTG诱导，在约22KD处出现明显条带，与预期分子量一致，表明目的蛋白在大肠埃希菌成功表达。目的蛋白在诱导表达菌超声裂解后的离心沉淀物中，表明目的蛋白以包涵体形式表达，结果见图4。表达产物包涵体经8mol/L尿素溶液溶解，梯度尿素溶液复性，Sephacryl S-400凝胶层析进行纯化，获得了0.31mg/mL、0.4mg/mL、0.74mg/mL、2.49 mg/mL四个浓度的RegIV重组蛋白，纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE分析，结果见图5。

注：M：DNA marker；1～10：菌落

图2 pET-30a-RegIV质粒双酶切验证

图3 pET-30a-RegIV序列比对结果

注：M：protein marker；1：未诱导表达菌菌体蛋白；2：IPTG诱导4h表达菌菌体蛋白；3：诱导表达菌菌体裂解上清液；4：诱导表达菌菌体裂解沉淀2mol/L尿素洗涤液；5：诱导表达菌菌体裂解沉淀8mol/L尿素溶解液。

图5 RegIV重组蛋白复性纯化产物的SDS-PAGE分析

3 讨论

本研究成功构建了pET-30a-RegIV原核表达重组质粒，转化大肠埃希菌E.coliBL21（DE3）获得了原核表达工程菌pET-30a-RegIV/BL21（DE3），经IPTG诱导，成功表达了重组人RegIV蛋白。重组人RegIV蛋白以包涵体形式表达，表达产物经梯度尿素溶液复性后使用Sephacryl S-400凝胶层析进行纯化，获得了纯度较好的的重组蛋白，为后续制备RegIV特异性抗体及开发新型的Reg IV抗癌靶向治疗药物奠定了基础。