提取方法对灰树花粗蛋白结构及功能特性的影响

彭志杰,杜娇,张羽婷,郭东东,雷佳钰,耿雪冉,2,孟俊龙,2,常明昌,2*

1(山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中，030801)2(山西省食用菌工程技术研究中心，山西 晋中，030801)

灰树花(Grifolafrondosa)，俗称莲花蘑、栗子蘑等[1-2]，属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、多孔菌属[3]，在日本称之为“舞茸”，属于珍贵的食药两用真菌[4]。

研究表明，灰树花具有抗病毒、抗生素、抗炎症、降血糖、降胆固醇和降血压的功效[5]，这得益于其中含有的多种活性物质，如活性多糖、核酸、多酚和氨基酸等，同时还是一种抗癌药源[6]，因此受到很多消费者的青睐。近年来，国内外对灰树花多糖的研究较多，主要表现在多糖的提取纯化、结构表征及生物活性等方面[5,7-8]，而对灰树花蛋白的研究相对较少，主要集中在提取[9-11]和酶解[12]方面，关于灰树花蛋白的理化性质及功能特性的研究，国内外鲜有报道。

本研究以灰树花子实体为原料，利用3种方法提取灰树花蛋白，并对蛋白的理化性质、功能特性进行研究，为灰树花及其粗蛋白在食品加工和相关产品的开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灰树花，浙江庆元县食用农产品批发部；

牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250，北京索莱宝生物科技有限公司；大豆油，山西太谷县农贸市场；NaOH、(NH4)2SO4、石油醚、无水乙醇、丙酮、盐酸、NaH2PO4、Na2HPO4,均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱(DF205)，北京医疗设备厂；万能高速粉碎机(YB-2500A)，永康市苏丰工贸有限公司；恒温振荡水浴锅(HHS-21-6)，上海博讯实业有限公司；磁力搅拌器(DF-101S)，北京中兴伟业仪器有限公司；高速冷冻台式离心机(Multifuge X1R)，贝克曼库尔特(美国)股份有限公司；真空冷冻干燥机(Alpha 2-4 LS Cbasic)，德国CHRIST公司；pH计(Orion Star A)，赛默飞世尔科技有限公司；马弗炉(KSJ)，上海电机(集团)公司；高速剪切乳化分散机(FA25)，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；石墨消解仪(SH220 N)、自动凯氏定氮仪(K9840)，山东海能科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计(U -1800PC)，上海美谱达仪器有限公司；电感耦合等离子体光谱仪(Optima 5300 D )，美国珀金埃尔默仪器有限公司；扫描电镜(JEOL JEM-6490L )，日本电子仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 灰树花子实体预处理

将灰树花子实体放入50 ℃恒温鼓风干燥箱烘干，之后进行粉粹，将粉碎后的子实体粉末过筛。灰树花粉末和石油醚按照1∶5(g∶mL)的比例进行混合，放到通风橱中搅拌0.5 h，然后再静置3 h，将上层石油醚回收，剩余部分放置在通风橱内自然风干，待完全干燥后收集粉末，即得到脱脂灰树花粉末。

1.3.2 灰树花基本成分测定

蛋白质测定：参照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白质的测定》；水分测定：参照GB 5009.3—2016 《食品中水分的测定》；灰分测定：参照GB 5009.4—2016 《食品中灰分的测定》。

1.3.3 灰树花蛋白的制备

1.3.3.1 碱溶酸沉法

根据陈雪洋等[13]的方法，略作修改。将脱脂灰树花粉末与蒸馏水按照1∶40(g∶mL)混合，用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH至13.0，之后将混合液在40 ℃恒温条件下浸提3 h；6 500 r/min离心15 min，收集上清液；用1 mol/L HCl溶液调节上清液pH至3.5，并且静置30 min，6 500 r/min离心15 min，弃去上清液；将沉淀用蒸馏水洗3次，再用0.05 mol/L NaOH溶液调节至中性，冷冻干燥得到粗蛋白。

1.3.3.2 盐析法

取适量脱脂灰树花粉末用蒸馏水溶解，料液比为1∶44(g∶mL)，混合后放入水浴锅中，51 ℃浸提36 min；浸提完成后6 500 r/min离心20 min，收集上清液；按照(NH4)2SO4沉淀表，加入(NH4)2SO4至饱和度为80%，在4 ℃下静置24 h，6 500 r/min离心20 min，去除上清液，然后将沉淀物溶于适量蒸馏水中透析24 h，冷冻干燥得到粗蛋白。

1.3.3.3 丙酮沉淀法

参照任雨贺等[14]的方法，稍加改动。称取适量脱脂灰树花粉末，加入10倍体积的10 mmol/L 磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(pH 7.2)搅拌均匀；将混合物4 ℃浸提120 min。于4 ℃下，6 500 r/min离心20 min，取其上清液于4 ℃保存。再向沉淀中加入等体积的10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.2)，进行2次浸提。于4 ℃下，6 500 r/min离心20 min，取上清液，将其与第1次上清液合并。向上述的蛋白粗提液中加入2.0倍体积丙酮，-20 ℃下静置12 h，6 500 r/min离心30 min，弃去上层液体，下层固形物置于-20 ℃挥干丙酮，再转移至-80 ℃过夜并冻干，蛋白质干粉于-20 ℃储存备用。

1.3.4 灰树花蛋白的纯度测定

精确称取适量蛋白样品并记录质量，移入干燥的定氮瓶中，按照GB 5009.5—2016 《食品中蛋白质的测定》进行实验，并利用自动凯氏定氮仪测定并计算蛋白纯度。

1.3.5 灰树花蛋白氨基酸组成的测定[15]

精确称取适量样品，记录质量并放置在备好的安瓿瓶中，按照GB 5009.124—2016 《食品中氨基酸的测定》测定氨基酸种类和含量。

1.3.6 微量元素检测分析

称取适量样品并记录质量，放入坩埚中，之后放到马弗炉中在500～600 ℃灼烧；待灼烧完成后自然冷却至室温，向坩埚中加入适量的体积分数25% HCl溶液，使坩埚内的混合物充分溶解，并定容至25 mL；取适量样液，利用电感耦合等离子体光谱仪进行测定分析。

1.3.7 扫描电镜分析

将灰树花蛋白用双面胶粘在样品座上，将样品座置于离子溅射仪，在样品表面蒸镀1层10～20 nm厚的铂金膜，调节电镜至最佳拍摄视野，并放大至合适倍数，观察并拍摄相应的样品照片。

1.3.8 溶解性的测定[16]

用去离子水配制10 mL 10 g/L的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH值为7.0，室温振荡10 min，4 000 r/min离心20 min，收集上清液采并用Bradford法测定蛋白含量，根据公式(1)计算蛋白溶解性：

(1)

1.3.9 持水性的测定[16]

准确称取0.5 g蛋白样品，记为m，称取空离心管质量，记为m1，将蛋白样品放入离心管中，并加入10.0 mL去离子水。混匀后静置30 min，5 000 r/min离心 20 min，离心结束后，除去上层清液，称量此时离心管的质量，记为m2。根据公式(2)计算蛋白的持水性：

(2)

1.3.10 持油性的测定[16]

准确称取0.5 g蛋白样品，记为m，称取空离心管质量，记为m1，将蛋白样品放入离心管中，并加入10.0 mL大豆油。混匀后静置30 min，5 000 r/min离心20 min，离心结束后，除去上层大豆油，称量此时离心管的质量，记为m2。根据公式(3)计算蛋白的持油性：

(3)

1.3.11 起泡性和泡沫稳定性的测定[16-17]

用去离子水配制10 g/L的蛋白溶液，量取15 mL蛋白溶液于100 mL的离心管中，体积记为0。利用均质机在10 000 r/min条件下均质2 min，室温下测定总体积1，静置30 min后再次测定总体积2。起泡性和泡沫稳定性分别利用公式(4)和(5)进行计算：

(4)

(5)

1.3.12 乳化性和乳化稳定性的测定[18-19]

用去离子水配制50 g/L的蛋白溶液，从中量取20 mL的蛋白溶液于100 mL离心管中，40 ℃水浴振荡反应20 min，之后向离心管中再加入20 mL大豆油混合，利用均质机在10 000 r/min条件下均质3 min；读取并记录乳浊液体积，0；乳化层体积，1；然后将乳浊液放入80 ℃水浴锅中水浴30 min，待反应完成后冷却至室温，2 000 r/min离心5 min，读取并记录剩余乳化层体积2。根据公式(6)和(7)分别计算乳化性和乳化稳定性：

(6)

(7)

1.4 数据分析

所有实验均进行3次，利用Excel软件进行统计和分析、SPSS 25软件进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 灰树花的基本组成成分

经过测定，灰树花的基本组成成分为水分11.37%、灰分6.94%、蛋白质含量19.91%。其中蛋白含量高于杏鲍菇(17.57%)[15]、云耳(10.30%)、银耳(9.60%)和岩耳(9.00%)[16]。因此可以认为灰树花是一种高蛋白含量的营养食品，能够作为潜在的蛋白来源。

2.2 灰树花蛋白的纯度

碱溶酸沉法，即等电点沉淀，是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，通过调节溶液pH，使蛋白沉淀析出。盐析沉淀法是利用蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同特性，通过向提取液中添加一定浓度的中性盐，使蛋白从溶液中沉淀析出。有机溶剂沉淀法是利用蛋白质与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使蛋白沉淀析出[20]。因此本试验利用这3种方法提取蛋白，并对其进行分析研究，以确定灰树花蛋白提取的最适方法。

经凯氏定氮测得3种方法提取得到的蛋白纯度如表1所示，碱溶酸沉法得到的蛋白纯度最高，达到45.35%，这是因为碱性溶液更有利于蛋白溶出，所以提取的纯度更高；盐析法次之，为35.87%；丙酮沉淀法得到的蛋白纯度仅有7.11%，推测原因可能是利用丙酮沉淀蛋白时不完全，并未将全部蛋白沉淀下来。以上结果初步说明，碱溶酸沉法是一种方便快捷并且效率较好的方法，可以广泛应用于蛋白质的提取。

表1 三种灰树花蛋白的纯度Table 1 Purity of Grifola frondosa protein extracted by three methods

2.3 灰树花蛋白的氨基酸组成

3种方法提取出的灰树花蛋白的氨基酸组成见表2，由于本实验采用酸水解法，在此过程中色氨酸被破坏，无法检测。3种方式提取的灰树花蛋白氨基酸种类丰富，共检测出17种氨基酸(丙酮沉淀法为16种，可能是因为蛋白的提取率过低，导致种类和含量较少)，这与杏鲍菇[15]、羊肚菌[21]的检测结果基本相近。由表2可知,3种提取方法中谷氨酸含量最高，分别占总氨基酸含量的13.71%、13.83%和14.56%，其次是天冬氨酸。这主要是因为谷氨酸和天冬氨酸均为酸性氨基酸，是食品中重要的鲜味物质，因此使得灰树花具有独特的味道[15,22-23]。3种蛋白的氨基酸组成之间存在较大差异，氨基酸含量各不相同，但是各种氨基酸所占比例大致相同，推测这可能与3种蛋白的纯度有关，纯度表示为蛋白的有效成分。由表1和表2综合分析可知，蛋白纯度越高，相应的氨基酸含量越多。试验结果间接表明3种蛋白提取方法的有效性，为不同目的性的蛋白提取提供一定依据。

碱溶酸沉法、盐析法与丙酮沉淀法的第一限制氨基酸均为苯丙氨酸，赖氨酸是碱溶酸沉法与盐析法的第二限制氨基酸，丙酮沉淀法的第二限制氨基酸为亮氨酸。同时蛋白中还含有8种人体所必需的氨基酸(丙酮沉淀中为7种)，分别占蛋白质中总氨基酸含量的40.46%、35.50%和33.08%，造成这一结果的主要原因是在使用不同溶剂浸提时，蛋白质的溶解效果有所差别；必需氨基酸与非必需氨基酸的比值分别为0.68、0.54和0.49，其中碱溶酸沉法的结果符合FAO/WHO提出的理想蛋白质规定(40%和0.6)[24]，由此确定碱溶酸沉法效果最为理想。

表2 三种方法提取灰树花蛋白的氨基酸组成 单位：mg/g

2.4 微量元素分析

矿物质是地壳中自然存在的化合物或天然元素，同时也是构成人体组织和维持正常生理功能必需的各种元素的总称，是人体必需的七大营养素之一。表3显示各种方法提取出的蛋白中矿质元素种类及含量，由表3可知，灰树花蛋白中含有多种矿质元素，其中以钙和镁为主，可以为机体提供天然的矿物质，满足正常生理代谢需求；同时也含有多种人体所必需的微量元素(铁、锌、铜和铬)和4种是人体可能必需的微量元素(锰、硅、镍和硼)。通过比较结果可知，盐析法的效果较好，各种微量元素含量明显高于其他2种方法，推测可能是由于盐析法的制备条件比较温和，未受到过多外界条件的干扰，并且使用的溶剂为水，相比之下更加有利于元素的析出和溶解。

表3 灰树花蛋白所含微量元素的种类和含量 单位：mg/g

2.5 灰树花蛋白的显微结构

利用扫描电镜对3种蛋白的表面微观结构和形态进行观察[25]，结果如图1所示。碱溶酸沉法得到的灰树花蛋白,整体呈现片状，边缘为不规则锯齿状，蛋白表面有轻微褶皱，组织结构较致密，表面平整光滑,与同种方法提取的杏鲍菇蛋白[15]相比，两者结构存在一定区别，杏鲍菇蛋白主要呈现为山脊状，部分蛋白中间有孔洞;观察图1-b可知，盐析法得到的蛋白与图1-a在一定程度上较为相似，但形态多样，有片状、球状、杆状等，可能是由于盐析过程中溶液盐浓度的变化导致蛋白分子之间聚合力发生改变，表面较为粗糙，中间有小孔径的孔洞，结构组织致密；图1-c为丙酮沉淀法得到的灰树花蛋白，外形呈现为大小不规则的块状或颗粒堆积，蛋白表面凹凸不平，组织结构较松散，推测可能是在用有机试剂进行沉淀时，蛋白的表面构象和外部形态发生变化。

a-碱溶酸沉;b-盐析;c-丙酮沉淀图1 灰树花蛋白的显微结构Fig.1 Scanning electron microscopy of Grifola frondosa protein

2.6 灰树花蛋白的功能特性

蛋白质是食品中重要的营养成分，其功能特性是其他食品成分不能替代的，对食品的品质具有决定性作用。3种提取方法得到的灰树花蛋白溶液在中性条件下的功能特性如表4所示。三者溶解性较为接近，可能是因为蛋白的疏水性较强，难以与水分子结合，使得溶解性较低。丙酮沉淀的蛋白持水性为63.94%，远低于其他2种，可能是丙酮作用时破坏了蛋白表面的极性基团，使该基团分子数目减少，一般来说蛋白的极性基团分子数目与持水性呈正相关。三者之间的起泡性及泡沫稳定性、乳化性及乳化稳定性大致相同。与碱溶酸沉方法提取的杏鲍菇蛋白[13]相比，灰树花蛋白的溶解性和持油性更好，这可能与蛋白的微观结构和非极性侧链对油脂的结合能力有一定关系。本次试验丙酮沉淀法得到的蛋白纯度过低，对其结构和功能测定缺乏良好的支撑，但试验均重复3次，结果仍具有一定的参考价值，只是不能充分说明蛋白特性。所以此方法下的理化性质和功能特性都不如其他2种提取方法，由此可以推断出丙酮沉淀法并不是一种良好的灰树花蛋白提取方式。

综合分析，碱溶酸沉法的各项结果均优于其他2种方法，可能是因为碱溶酸沉法提取的蛋白纯度最高、含量较高，因此碱溶酸沉法可被认为是一种灰树花蛋白的有效提取方法。

表4 灰树花蛋白功能特性测定结果 单位：%

3 结论

本试验以碱溶酸沉法、盐析法和丙酮沉淀法提取得到的灰树花蛋白为研究对象。结果发现，3种方法得到的蛋白在理化性质和功能特性方面存在一定差异。对3种方法提取出的蛋白氨基酸进行分析，发现碱溶酸沉法的结果较好，氨基酸含量较多。同时3种蛋白中微量元素以钙和镁为主，通过比较3种方法所得蛋白的溶解性、吸水和吸油性、起泡性和乳化性可知，碱溶酸沉法得到的蛋白具有更好的理化和功能特性。综上分析，碱溶酸沉法可被认为是一种有效的蛋白提取方法。本研究为今后灰树花蛋白的开发及应用提供了相应的实验支撑。