不同水温对黑斑蛙胚胎发育的影响

2020-11-20王玉柱刘文舒李思明黎德兵郭小泽

水产科学 2020年6期

王玉柱，刘文舒，李思明，黎德兵，郭小泽

( 1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌 330200； 2.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130 )

黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)，属蛙科，侧褶蛙属，又称黑斑侧褶蛙，广泛分布于东亚、东北亚地区，是中国大陆分布最广的两栖动物之一[1]。黑斑蛙主要栖息在稻田、池塘、水渠、小河等地[2]，可食用和药用[3]，具有重要生态和经济价值。

黑斑蛙等变温动物主要依靠环境中的热源调节体温和机体代谢[4]，水温是其胚胎发育的重要影响因子之一。当水温过高时，水中溶解氧含量降低[5]，机体能量消耗速度加快[6]，机体各类亚细胞结构的功能和交互作用减弱[7]，导致胚胎死亡率增加，生长发育增速[8]；而遭受低温影响时，蛙类胚胎发育会减缓，体质量降低[9]。近年来，温度对两栖类胚胎生长发育影响的研究逐渐增多，在饰纹姬蛙(Microhylafissipes)[10]、东北林蛙(Ranadybowskii)[11]、大蟾蜍(Bufogargarizans)[12]、棘胸蛙(R.spinosa)[13]等两栖类动物上已有报道，但是关于水温对黑斑蛙胚胎发育的研究鲜有报道。笔者通过设置不同水温来研究黑斑蛙胚胎发育的变化，以期对黑斑蛙胚胎发育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑斑蛙卵来源于江西省九江市都昌县渔童黑斑蛙养殖基地，试验地点为江西省农业科学院畜牧兽医研究所。试验用水为经过充分曝气的地下水，pH 7.2，溶解氧>5 mg/L。孵化缸为50 cm×30 cm×44 cm玻璃缸，每日注换1/3体积等温水，孵化缸内放置可定温加热器和数显温度计。

1.2 试验方法

设定18、21、24、27、30、33 ℃ 6个水温梯度，每个梯度3个平行；共设置18个孵化缸，并对18个孵化缸进行标号。选取蛙卵发育阶段为15期(根据文献[14]对黑斑蛙发育阶段分类标准判定)的卵块数团，分成含100粒卵的小卵块18团，随机放入18个孵化缸内，用木框棉网托举在水面上，保持卵块浸没在水面以下约1 cm，光周期为12L∶12D。卵块放置完毕后进行计时，每隔12 h记录胚胎的发育阶段；在各试验组19期(19期为心跳期，大多数蝌蚪在此时脱出卵黄膜，在咽区腹侧部可见微弱心跳)时统计孵化率，25期(25期时鳃盖已发育完成，可以开始摄取食物)时统计各组成活率、发育指标(体长、体质量、体宽、尾长)。发育指标测定标准如下：

体长：吻端到尾末端处长度；

体宽：体两侧最宽处长度；

尾长：肛门到尾末端处长度。

孵化率和25期成活率计算公式如下：

孵化率/%=n1/n0×100%

25期成活率/%=n2/n1×100%

式中，n0为投放黑斑蛙卵数量，n1为19期出膜蝌蚪数量，n2为25期存活蝌蚪数量。

1.3 数据处理

本次试验数据用Excel和SPSS 24.0处理，P<0.05为差异显著。所有描述性统计值使用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 不同水温对黑斑蛙胚胎孵化率和25期成活率的影响

根据文献[14]对黑斑蛙生长阶段的划分，大多数的黑斑蛙胚胎在19期时孵化成蝌蚪，在此阶段可以观察到胚胎外包裹的卵黄膜破裂，腹侧部可以看见微弱的心脏波动。由表1可知，18 ℃水温条件下，黑斑蛙胚胎孵化率为96.41%，略低于其他温度梯度，但是各温度梯度之间孵化率并无显著差异(P>0.05)。黑斑蛙胚胎脱离卵黄膜的保护后，更易受到环境因素的影响，在胚胎发育至25期时，成活率出现了较为明显的差异。21、24、27 ℃水温条件下25期成活率显著高于18、30、33 ℃(P<0.05)，27 ℃水温条件下25期成活率(84.63%)比33 ℃(42.53%)高出98.99%，成活率态势依次为27 ℃>24 ℃>21 ℃>30 ℃>18 ℃>33 ℃。

2.2 不同水温对黑斑蛙发育指标的影响

黑斑蛙蝌蚪发育至25期时，各器官基本发育完全，正式开始摄取食物。在25期测量各组胚胎的体质量、体长、尾长和体宽(表2)，18、21、24、27、30 ℃水温下黑斑蛙蝌蚪体质量差异不显著(P>0.05)，21、24、27、30、33 ℃水温条件下黑斑蛙蝌蚪体质量差异也不显著(P>0.05)，但黑斑蛙蝌蚪体质量呈现随着温度的升高而逐渐上升的趋势，33 ℃体质量(10.30 mg)比18 ℃(6.65 mg)高出54.89%。体长、尾长随着水温的升高表现出先升后降的趋势，18 ℃水温下体长和尾长最小，分别为(7.97±0.49) mm和(4.85±0.32) mm，30 ℃水温下体长和尾长最大，分别为(8.90±0.36) mm和(5.48±0.39) mm；30 ℃比18 ℃体长和尾长高出11.67%和12.99%。24、27、30、33 ℃水温下黑斑蛙蝌蚪体长和尾长明显大于18、21 ℃。体长态势依次为30 ℃>27 ℃>33 ℃>24 ℃>21 ℃>18 ℃。尾长态势依次为30 ℃>24 ℃>27 ℃>33 ℃>21 ℃>18 ℃。黑斑蛙蝌蚪的体宽在不同水温中也表现出先增后减的趋势，30 ℃水温下黑斑蛙蝌蚪体宽最大，为(2.13±0.17) mm，18 ℃水温下体宽最小，为(1.94±0.14) mm。30 ℃比18 ℃体宽高出9.79%，体宽态势为30 ℃>27 ℃>24 ℃>33 ℃>21 ℃>18 ℃。

表1 不同水温条件下黑斑蛙胚胎孵化率和25期成活率Tab.1 Survival rate of phase 25 and hatching rate of frogP. nigromaculatus embryos at different water temperatures

2.3 不同水温对黑斑蛙胚胎发育历期的影响

在不同水温条件下，黑斑蛙胚胎的发育速度表现出明显差异。当环境水温降低时，黑斑蛙胚胎的发育历期有大幅延长，18 ℃水温下黑斑蛙胚胎从15期发育至19期孵化用时(48 h)比33 ℃水温下用时(10 h)高出380%(图1)；孵化时长(y)和水温(x)的关系式为：y=1.1786x2-15.85x+62.6，r2=0.9931(图2)。在黑斑蛙胚胎生长至25期时，33 ℃水温下发育历期最短，为60 h(图1)；18 ℃水温下胚胎发育历期最长，为204 h，比33 ℃高出240%；发育时长(y)和水温(x)的关系式为：y=4.2857x2-57.429x+252，r2=0.9883(图3)。

表2 不同水温条件下黑斑蛙发育指标Tab.2 Developmental indicators of frog P. nigromaculatus at different water temperatures

图1 不同水温条件下黑斑蛙胚胎发育历期Fig.1 Embryonic development of P. nigromaculatus at different water temperatures

图2 不同水温下胚胎发育至19期时所用时间Fig.2 The time taken for embryo development to phase 19 at different water temperatures

图3 不同水温下胚胎发育至25期时所用时间Fig.3 The time taken for embryo development to phase 25 at different water temperatures

3 讨论

3.1 蛙类胚胎发育对水温的要求和适应性

蛙型目生物在我国有240多种，分布地区广泛。由于蛙的种类和分布地区的不同，蛙类胚胎发育对水温的要求和适应性有很大差异。中国林蛙(R.chensinensis)在10～14 ℃水温中胚胎孵化率可以达到97%以上，并且在8～20 ℃水温中均可正常发育[15]；棘胸蛙在20～23 ℃时，孵化率超过80%，但水温超过26 ℃时，胚胎就出现了畸形发育[13]；虎纹蛙(R.tigrinarugulosa)的最适胚胎发育水温约25 ℃[16]；饰纹姬蛙在28 ℃水温下具有最佳的生长表现[10]；本试验中，黑斑蛙在24～27 ℃水温下得到了最高的孵化率、最低的死亡率和最优的生长指标。综上可知，不同蛙类胚胎发育对外界水温的变化均十分敏感，而不同蛙类对水温的要求和适应性有较大区别。另外，不同地理种群的同种蛙类胚胎发育对温度的要求和适应性可能会有所差异。分布于海南省和广东省的虎纹蛙分别在32 ℃和25 ℃孵化率最高[17-18]；北京和沈阳地区的黑斑蛙胚胎在20 ℃水温下由15期发育至25期分别耗时160.4 h和204.69 h[19-20]，本试验表明，南昌地区黑斑蛙胚胎在18 ℃水温下由15期发育至25期需要204 h，在21 ℃水温下需要144 h。然而，蛙类胚胎发育对温度的可塑性和适应性很强，不同地区蛙类之间对温度的需求和适应性差异可能仅仅是因为胚胎发育过程中当地环境不同所致，具体原因还需要进一步研究。

3.2 不同水温对黑斑蛙胚胎孵化率和成活率的影响

与常见蛙类相比，黑斑蛙胚胎具有较强的孵化温度适应性。本试验中，各组黑斑蛙的孵化率无显著差异，均在96.41%以上。与其他蛙类相比，环境水温由22 ℃升至34 ℃时，牛蛙(R.catesbeiana)孵化率由63%降至29%[21]；环境水温由25 ℃升至30 ℃，虎纹蛙孵化率由94.5%降至84.2%[16]；环境水温由20 ℃升至32 ℃，中华蟾蜍(Bufogargarizans)胚胎的16期死亡率由1.7%升至100%[22]。黑斑蛙胚胎孵化对水温的适应性明显强于上述蛙类。孵化温度适应性是胚胎发育的适应性和可塑性的表现之一，也是黑斑蛙分布纬度范围广泛的原因之一。

水温对黑斑蛙胚胎成活率具有显著影响。本试验结果表明，在21～27 ℃水温中的黑斑蛙胚胎成活率显著高于其他水温，24～27 ℃成活率在82.42%以上。本试验结果与棘胸蛙[13]、虎纹蛙[17]等蛙类相似，最大成活率温度区间均在20 ℃以上，较中国林蛙[23](10～20 ℃)和中华蟾蜍[24](20 ℃以下)等蛙类高；上述蛙类的最大成活率温度区间均在6 ℃以上，较宽的温度区间是蛙类积极适应环境的表现之一。极端温度会造成蛙类机体各类亚细胞结构的功能和交互作用减弱，导致成活率降低[7]。蛙类胚胎神经快速发育时期对温度非常敏感[22]，当温度过高或过低时，可能会导致胚胎各胚层发育速度不协调，造成神经系统功能紊乱而引起死亡；另外，当温度高于最适胚胎发育温度区间时，胚胎卵黄中营养的供给速度可能不能满足新陈代谢，导致能量供给紊乱，引起胚胎死亡[21]。

3.3 不同水温对黑斑蛙胚胎发育历期的影响

黑斑蛙胚胎发育的15期为纤毛动作期，中腰部左右神经褶靠近，体表面出现纤毛流，外形特征明显；王应天[25]对黑斑蛙早期胚胎发育的研究结果表明，黑斑蛙胚胎由15期发育至25期历期约占黑斑蛙胚胎发育总历期的4/5。本试验选用的黑斑蛙卵为自然状态下产卵，从基地转移到实验室的过程中进行了部分发育，所以选取外形特征十分明显的15期胚胎进行试验，以保证所有试验材料发育起点相同。

黑斑蛙胚胎发育历期在不同水温环境中呈现明显变化，随着水温的升高，胚胎发育历期显著缩短，当水温由18 ℃升至33 ℃时，胚胎15～19期耗时延长了380%。牛蛙[21]在22 ℃水温下15～19期耗时比34 ℃延长214.29%，虎纹蛙[16]20 ℃比30 ℃延长249.59%，东北林蛙[11]3个不同地理种群12 ℃比24 ℃分别延长了108.84%、104%、105.36%。本试验结果与上述结果基本一致，在一定范围内高温能够促进蛙类胚胎和蝌蚪发育速度，加快胚胎孵化过程。这可能与胚胎发育的适应性与可塑性有关[26]。

胚胎发育的适应性和可塑性在自然界中广泛存在，在两栖类和鱼类中有着明显的表现。胚胎经历了细胞分裂、囊胚发育、神经褶皱的形成、器官的发育和生长等过程，其适应性和可塑性具体表现在各个发育阶段，耗氧量、能量利用效率、卵黄转化效率、心率等可以随着温度的变化而改变。当水温升高时，澳洲莫斯蛙(Bryobatrachusnimbus)[27]胚胎单位时间内能量消耗持续升高，发育速度加快，耐热能力增强，另外当水温升高时，尽管胚胎耗氧量更高，总能量的消耗却会减少[28]；鲱型白鲑(Coregonusclupeaformis)[29]相关研究同样表明，高温能提高胚胎的心率和耗氧量。澳洲肺鱼(Neoceratodusforsteri)[30]随着水温升高，孵化后卵黄质量也随之升高，增加了胚胎孵化后的可利用内源能量。上述研究结果均伴随着胚胎发育阶段的适应性和可塑性变化，或者说上述变化均为胚胎发育适应性和可塑性的组成部分和具体体现。

胚胎发育的适应性和可塑性会直接受到环境因素或者调整应对环境因素能力的影响[31]，卵黄膜在应对这些影响时发挥了重要作用。卵黄膜在胚胎发育过程中既提供了保护胚胎免受伤害、减少水分流失、保存胚胎所需营养物质的“效益”，又产生了阻碍氧气吸收和外部食物获取、限制大小和空间位置的“成本”。当外界环境温度偏离正常孵化温度，改变卵黄膜内外的“成本/效益”比时，胚胎就会提前或者推迟孵化。

3.4 不同水温对黑斑蛙发育指标的影响

黑斑蛙胚胎表现出了较强的温度适应性，但是本试验中高温组(33 ℃)和低温组(18 ℃)经过60 h和204 h的发育，在25期胚胎发育完成时发育指标产生明显的差异，表现为单体体质量相差54.89%，体长相差8.78%，尾长相差8.87%，体宽相差3.61%，胚胎死亡率相差19.08%。王守红等[10,22]的研究也同样表明，当蛙类胚胎发育水温偏离适宜温度时，蛙的全长、体宽等发育指标都会受到显著影响。蛙类体温与环境水温密切相关，当环境水温超过蛙类等温区间时，蛙类体温随着环境水温的升高而升高，但是会低于环境水温。过高的体温会造成变温动物心率和耗氧量的增加，加快代谢率，提高生长速度[32-33]；过低的体温又会造成胚胎发育时间的延长，过多的营养物质用来维持生命活动。这种代谢速率的过快或者过慢不是没有代价的，在极端水温下蛙类胚胎发育指标会偏离正常值，造成蛙胚胎发育畸形、成活率下降。极端的孵化温度还可能会造成后期发育过程中生存能力降低，比如早期孵化的青蛙后肢较短和跳跃能力较弱，造成躲避天敌和捕食能力下降[34]；然而有对林蛙的研究表明，在蝌蚪期因外界温度差异造成的蝌蚪耐热性的差异可能不会延续到变态之后[35]。综上，不同水温会对黑斑蛙胚胎发育指标产生显著影响。