水生拉恩菌研究进展

梁 婧，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋

( 天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384 )

水生拉恩菌(Rahnellaaquatilis)，属肠杆菌科，拉恩菌属，为革兰氏阴性直杆菌，有鞭毛，大小为(0.5～0.7) μm×(2～3) μm，兼性厌氧，化能有机营养菌[1]。最早自淡水中分离获得水生拉恩菌，DNA杂交试验发现，H2菌株与肠杆菌属细菌相似性仅有37%，从而将其确定为一个新属种[2-3]。水生拉恩菌在自然界中分布广泛，主要存在于淡水、土壤中[4-5]。在人体、蜗牛肠道以及动、植物性食品中也可检出水生拉恩菌[6]。也有文献报道，在牛奶[7]、鸡蛋[8]、鸡肉[9]以及鱼粉、鱼片[10]中分离检测出该菌。最近，采用梅里埃API细菌鉴定系统结合质谱(MS)技术在野生绿头鸭(Anasplatyrhynchos)[11]、斑头雁(Anserindicus)[12]的粪便中检测出水生拉恩菌。

水生拉恩菌作为一种条件致病菌，对水产动物和人类均有致病性，可导致鲫鱼(Carassiusauratus)[13]、雀鲷(Stegastesbeebei)[14]、中国林蛙(Ranachensinensis)[15]患病，在感染过程中引起鱼类体表胸鳍、尾鳍部位岀血和腹水等主要临床症状。水生拉恩菌主要可以导致免疫低下人群感染，引起菌血症、败血症等，但是目前对水生拉恩菌感染水生动物确切的发病机理还知之甚少[16-18]。笔者较全面地综述了水生拉恩菌的致病性、药敏性、基因组特征以及理化与分子鉴定等国内外研究进展，旨在为水生拉恩菌分子流行病学、致病机理、功能基因组学以及诊断与防治研究提供科学参考。

1 水生拉恩菌的致病性与药敏性

1.1 对水产动物的致病性

近几年，对水生拉恩菌感染鱼类的组织分布、致病机理及其分子诊断等相关研究备受关注[13-15]。研究表明，水生拉恩菌在污染鱼类肌肉、肠道及内脏组织器官中比较常见[13,16]。Alikunhi等[17]基于16S rRNA测序证实水生拉恩菌为鱼类肌肉污染样品中的优势菌种。周玉法等[18]发现，草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)的肠道微生物主要菌群为拉恩氏菌属细菌，其含量达106cfu/g数量级。Lü等[13]自患病鲫鱼体内(肝胰脏、肾脏和脾脏)中分离获得革兰氏阴性杆菌KCL-5，通过细菌形态观察、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB基因测序鉴定KCL-5菌株为水生拉恩菌。Xue等[15]从中国林蛙肝脏中分离出1种革兰氏阴性菌bf008，发现该菌与12个水生拉恩菌参考菌株的亲缘关系最近，最终将bf008分离菌株鉴定为水生拉恩菌。Wei等[19]从虾虎鱼(Yongeichthyscriniger)肝脏分离到产河豚毒素XL-1菌株，通过细菌形态学、生理生化特征和16S rDNA系统发育分析发现，菌株XL-1与水生拉恩菌亲缘关系最近。Skrodenyte等[20]通过PCR扩增和16S rRNA基因测序在亚东鲑(Salmotruttafario)肠道中首次检测水生拉恩菌(21%)。

Lü等[13]进行水生拉恩菌KCL-5菌株的动物感染试验，通过人工腹腔注射剂量为2.0×109cfu/mL对鲫鱼的致病性研究，在攻毒试验14 d后感染鲫鱼累积死亡率为73.3%，半数致死量为1.7×108cfu/mL，感染病鲫鱼行动缓慢，胸鳍基部、尾鳍等部位有岀血现象，腹腔有腹水，肝脏和肾脏等脏器处有瘀血点。最近，Lamb等[14]从患病雀鲷和锯鳞鱼(Myripristisleiognathus)皮肤病变部位中分离出2株细菌，通过16S rRNA基因测序将其鉴定为拉恩菌属一个新种(R.inusitata)，患病鱼主要表现为皮肤损伤，鳞屑和表皮之间出血，背鳍基部病变明显，皮肤与肌肉层容易分离等临床症状。水生拉恩菌毒力因子主要有从鱼肉中检测出的水生拉恩菌热不稳定毒素(lt)基因、热稳定毒素(st)基因等[7]，以及在KCL-5菌株中检测到yhaV毒力基因[13]。除此之外，水生拉恩菌的发病机制可能与脂多糖(LPS)有关，认为脂多糖酰基和磷酸基团是影响其毒性强弱的主要因素[21-23]。

1.2 对人的致病性

水生拉恩菌对人有致病性，可感染血液导致人类的菌血症[24]、败血症[25]、心膜炎[26]、中耳炎[27]以及肠胃炎等[28]多种疾病，感染后主要引起腹痛、腹泻、发热、咳嗽等一系列症状，并可以在患者之间交叉传播感染[28-33]。多数水生拉恩菌感染人导致条件性致病，尤其对免疫功能低下者，或存在外科伤口、老人和儿童等更易感染[31,34]。近年来，主要从糖尿病、免疫缺陷、肿瘤患者等有基础疾病人群的临床病例样品中分离，包括创伤、菌血症、艾滋病、白血病、胃肠炎以及免疫功能低下患者[31-33]，偶尔也从健康人痰液、尿液、血液和粪便分离获得[29-30]。但是，对人类感染水生拉恩菌的分子致病机理研究，目前国内外尚未见文献报道。

1.3 药敏性

研究表明，大多数水生拉恩菌对氨基糖苷类(庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素等)、四环素和喹诺酮类等药物敏感，有些菌株对碳青霉烯类、呋喃类天然敏感；多数对头孢菌素类、青霉素类耐药[5]；也有文献报道对磺胺类药物(磺胺甲恶唑、复方新诺明等)敏感或耐药[25,32]。一般认为，水生拉恩菌分离株耐药性存在差异，这可能与不同菌株来源、环境、患者个人身体状况以及使用药物治疗有关。已报道水生拉恩菌和水生拉恩菌基因组2菌株无天然抗生素敏感性差异，而吡咯烷酮肽酶(Pyrase)敏感性可能成为区分水生拉恩菌和水生拉恩菌基因组2菌株的决定因素[35]。

最近，从鲫鱼体内分离出的水生拉恩菌KCL-5分离株对大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素等药物高度敏感，但对头孢菌素和磺胺类药物有耐药性[13]。Xue等[15]报道蛙源分离株bf008对磷霉素和头孢唑林等药物耐药，对头孢哌酮、头孢西丁等药物敏感，这与从人类临床检测的药敏试验结果基本相符[13,15]。研究表明，A类超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是一类由质粒介导，能水解广谱青霉素、头孢霉素、单环酰胺类、β-内酰胺类药物的高活性β-内酰胺酶，可通过水解灭活头孢菌素类抗生素，对内酰胺酶抑制剂(克拉维酸)等敏感[36-37]，这与水生拉恩菌耐药性基本一致。对水环境肠杆菌而言，A类超广谱β-内酰胺酶被认为是引起人类感染的耐药基因来源，水生拉恩菌也可以产生A类超广谱β-内酰胺酶(RAHN-1、RAHN-2)[38]，以上研究有助于理解水生拉恩菌的耐药机制，有待进一步深入研究。

2 基因组特征

近几年，国内外学者对饮用水、植物根际土壤等来源的水生拉恩菌基因组研究进行了文献报道[39-42]。Martinez等[40]在法国饮用水中分离获得水生拉恩菌CIP 78.65菌株(同等于模式菌株ATCC 33071)，最早于2012年报道其全基因组序列。结果表明，该菌株CIP 78.65基因组由1个环状染色体、3个质粒组成，其中染色体大小为4 861 101 bp、GC比例为52.12%，质粒pRahaq201、pRahaq202、pRahaq203长度分别为463 906 bp(GC比例52.29%)、115 487 bp(GC比例50.69%)和8604 bp(其中含有一个缺口补全长度为1950 bp)。通过生物信息学方法分析，发现CIP 78.65菌株共有4970个推测基因编码蛋白、104个假基因、76个tRNA基因和7个rRNA基因操纵子。

Guo等[41]从北京葡萄园土壤中分离出1株水生拉恩菌HX2菌株，并研究报道其基因组序列草图，该基因组包括1个环状染色体大小为4 962 173 bp，2个环状质粒pRA1、pRA2长度分别为570 951 bp、123 675 bp，推测含有4541、519和120个基因蛋白开放阅读框(ORFs)。该基因组包括76个tRNA基因、22个rRNA基因操纵子。此外，HX2菌株染色体GC比例为52.2%，质粒pRA1、pRA2的GC比例分别为52.0%、50.9%。

Martinez等[42]从美国低pH、高含量硝酸盐、重金属等污染土壤中分离拉恩菌属未定新种(Rahnellasp.)Y9602菌株，对其全基因组序列研究报道。结果表明，Y9602菌株基因组大小为5 614 252 bp，其中染色体大小为4 864 217 bp，GC比例为52.4%，含有2个质粒pRAHAQ01、pRAHAQ02大小分别为616 549 bp(GC比例52.1%)、133 486 bp(GC比例48.3%)。该菌株基因组包含5184个蛋白编码基因，73个假基因，76个tRNA基因和7个rRNA基因操纵子。

此外，Rbzhon等[43]对水生拉恩菌属中53个分离菌株进行基因组测序分析，在水生拉恩菌属中共发现11个质粒，其中7个属于ColE1家族、1个属于ColE2家族，还有3个与滚环质粒同源性较高。截至2019年3月，在美国国立生物技术信息中心数据库中已登录有12株水生拉恩菌基因组序列，发现多数来源于土壤、水体，部分来源于人类和动物性食品，多数菌株的基因组大小在3 995 000～5 656 799 bp，GC比例为52.08%～52.36%，编码基因数量为3688～5243，编码蛋白数量为3525～5012，假基因数量为7～125。由此，总结7个典型水生拉恩菌分离菌株的来源、基因组大小、GC比例、rRNA、tRNA基因、蛋白编码基因、假基因数量等分子特征(表1)。

表1 水生拉恩菌的基因组特征Tab.1 Genomic characteristics of R. aquatilis

3 理化与分子鉴定

3.1 生理生化特性

水生拉恩菌在营养琼脂(NA)、大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)和血琼脂平板(BA)上容易生长，其中大豆酪蛋白琼脂平板上生长较好。水生拉恩菌培养24 h后可见灰白色、隆起、光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落，不溶血、不产色素。在25 ℃半固体生长时，可由周鞭毛运动形成毛刷状[1]。大多数水生拉恩菌分离菌株在4 ℃下生长缓慢，可在25～35 ℃下生长，最适pH 7.0～7.5[1,44]，可以利用有机酸、氨基酸作为碳源生长[45,46]。在室温、4 ℃条件下可以通过大豆酪蛋白琼脂培养基或营养琼脂保存，也可保存在10%甘油肉汤或-80 ℃牛血清中，其中冷冻干燥保藏法最佳[1]。

水生拉恩菌标准菌株ATCC 33071能发酵糖类产酸，包括阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、鼠李糖、果糖、水杨苷等，并且硝酸盐还原、氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶为阳性[1]。大多数菌株对苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、硫化氢、明胶液化试验等为阴性；可利用柠檬酸盐，七叶苷水解为阳性，吲哚、甲基红和V-P试验呈弱阳性。少数菌株对α-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、磷酸酶为阳性，对赖氨酸分解酶、脂肪酶、精氨酸水解酶为阴性[1,47]。

最近，从患病鲫鱼、雀鲷、锯鳞鱼和林蛙等水生动物体内分离到致病性水生拉恩菌。Lü等[13]对鲫鱼水生拉恩菌KCL-5菌株、中国林蛙bf008菌株在氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶以及糖类利用等主要生理生化特性与模式菌株ATCC 33071进行比较鉴定，结果表明，在利用葡萄糖、阿拉伯糖、山梨糖醇、阿糖醇等糖类发酵产酸特性一致，但是在氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶等反应特性明显不同(表2)。

表2 水生拉恩菌的主要生理生化特性Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of R. aquatilis

3.2 分子鉴定

近年来，主要采用16S rDNA、gyrB基因测序、DNA-DNA分子杂交技术等进行水生拉恩菌的分子鉴定[48-52]。Brenner等[45]采用常规细菌生化试验、碳源利用试验、DNA杂交(羟基磷灰石法)和16S rRNA测序等方法，对水体、蜗牛和人源水生拉恩菌进行分类与鉴定，结果表明，51株分离菌株由拉恩菌属中3个亲缘关系密切的基因种组成，但是通过生物表型无法区分水生拉恩菌和另2个新分离菌种的确切关系，因此通过16S rRNA测序分析将新物种命名为水生拉恩菌基因种2和基因种3。目前，水生拉恩菌属含有水生拉恩菌一个模式种，已发现5个新种，分别为R.victorianasp. nov.(模式菌株FRB 225=LMG 27717=DSM 27397)、R.variigenasp. nov.(水生拉恩菌基因种2、模式菌株CIP 105588=LMG 27711)，R.inusitatasp. nov.(水生拉恩菌基因种3、模式菌株DSM 30078=LMG 2640)，R.bruchisp. nov.(模式菌株FRB 226=LMG 27718=DSM 27398)和R.woolbedingensissp. nov.(模式菌株FRB 227= LMG 27719= DSM 27399)[48]。Bakhshandeh等[44]通过检索GenBank数据库中16S rDNA序列对从土壤中分离菌株M100进行分子鉴定，证实M100菌株为水生拉恩菌，16S rDNA序列相似性为99%。最近，Xue等[49]从党参(Codonopsisclematidea)根际土壤中分离到一株革兰氏阴性菌SYP-B210T，采用16S rRNA基因测序将其鉴定为水生拉恩菌。Li等[50]从中国东部某地土壤中筛选出17株菌株，通过16S rDNA基因测序、Biolog鉴定系统及生物学表征，将其中分离菌株JZ-GX1鉴定为水生拉恩菌。Brady等[48]从患病植物根际土壤中分离到32株革兰氏阴性菌株，采用gyrB、rpoB、infB和atpD等基因序列多位点分析(MLSA)、16S rRNA基因测序、微孔板和微量培养板进行DNA-DNA杂交检测、荧光测定方法鉴定发现水生拉恩菌为优势菌株。Yu等[51]通过16S rRNA序列长度多态性(RFLP)方法检测表明，水生拉恩菌在蝠蛾(Hepialusgonggaensis)肠道菌群中为优势细菌，在16S rRNA克隆文库中约为45.6%。Zhao等[52]从铜污染土壤中分离菌株LRP3，通过细菌形态学、生理生化反应和16S rRNA序列分析，鉴定LRP3菌株为水生拉恩菌。

3.3 其他特性

近几年，有文献报道一些水生拉恩菌分离菌株具有益生特性，在植物病害防治、环境污染处理等方面有应用前景[42,53]。国外学者研究发现，水生拉恩菌在奶牛粪便好氧降解过程中为优势菌种，并在体外显示较强的植酸盐利用性[54]，此外，水生拉恩菌还可以固定氮，产生吡咯喹啉奎宁[41]、吲哚-3-乙酸和抗菌物质，可促进植物生长并且抑制根茎疾病[44,53]。水生拉恩菌不仅具有溶解矿物磷酸盐的能力，在被污染的水源中可促进磷酸铀矿化，而且可以产生植酸酶和碱性磷酸酶等多种活性物质，对重金属污染土壤的生物修复起重要作用[52]。

4 研究展望

水生拉恩菌作为一种条件性致病菌，国内外的研究仍处于初步开展阶段，主要集中在人类临床检测、继发感染病例的研究报道[27]，针对水产动物致病性菌株的分离鉴定与致病性研究相对较少。迄今，仅有对植物、土壤源水生拉恩菌基因组测序研究报道[40-41]。然而，目前尚未见对水产动物致病性水生拉恩菌基因组测序的分析研究。最近，笔者及其课题组已从发病鲫鱼体内分离到致病性水生拉恩菌KCL-5菌株，同时进行基因组测序研究工作，并发现该菌基因组的分子特征及一些耐药和毒力基因(待整理发表)。此外，人们仅发现鲫鱼源水生拉恩菌毒力yhaV基因[13]以及食物源毒力因子热不稳定毒素(lt)基因、热稳定毒素(st)基因[7]与其致病性有关，也有报道该菌含有超广谱β-内酰胺酶RAHN-1、RAHN-2耐药基因等[38]。研究表明，水生拉恩菌毒力yhaV基因是一种核糖体依赖性毒素，属于大肠杆菌(Escherichiacoli)Ⅱ型毒素—抗毒素(TA)系统[55]，主要通过与70S或50S核糖体亚基结合，从而切割依赖性mRNA翻译[56]，但其靶mRNA调控机制仍无文献报道。由此可见，水生拉恩菌毒力和耐药基因功能以及确切的致病机制等仍不清楚，今后对水产动物水生拉恩菌的流行病学、致病机理以及功能基因组学的分析，有待于进一步深入开展研究。