噬菌体在水生动物病害防治中的应用问题和解决策略

吕 可，赵前程，刘婧懿，马子祯，徐永平，马永生

( 1.大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023；2.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024 )

水产品为人类提供了17%的动物蛋白摄入，其中约50%来自水产养殖业。2014年世界水产品养殖产量为7.380×107t，水产养殖业对人类水产品消费的贡献首次超过野生水产品捕捞[1]。我国是世界第一水产养殖大国，2018年全国水产养殖量为4.991×107t，水产养殖量占世界总量的60%以上[2]。然而，集约化养殖模式不可避免带来养殖环境污染和水产动物病害频发的问题。全国每年因病害造成的水产养殖经济损失约为150亿元，并以细菌性疾病为主，约占全部病害经济损失的50%以上[3]。

长期以来，水产养殖动物细菌性病害的防治主要依赖于抗生素(包括人工合成抗菌药物)。据统计，1996—2013年我国水产养殖中曾报道使用的抗生素有8大类，共计20个品种，目前有11个品种被批准允许应用于水产养殖[4-5]。但抗生素的大量使用，带来了水产品药物残留、细菌耐药性和环境污染等突出问题。研发新型抗生素替代品乃迫切之需，一些具有潜在应用前景的抗生素替代品相继被开发应用，如寡聚糖、益生菌、天然植物提取物及噬菌体等。

噬菌体是一类细菌性病毒，其中烈性噬菌体在感染宿主菌后能在较短时间内完成复制周期，并裂解宿主菌释放子代病毒颗粒，从而达到抗菌效果。噬菌体是一种极具潜力的抗生素替代品，且已在陆生动物和水生动物病害防治中显示出良好的应用前景。与传统的抗生素相比，噬菌体具有专一性强、可自我复制增殖、来源丰富、筛选方便等突出优势。笔者综述了目前国内外噬菌体在鱼、虾、贝类等水产动物病害防治中的最新研究概况、存在的问题及解决策略，旨在为我国水产养殖业发展绿色生态防控技术提供新思路。

1 噬菌体在水产养殖动物病害防治中的应用研究

早在20世纪80年代，Wu等[6]首先提出用噬菌体防治嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，并证实了噬菌体的体外杀菌效果，但并未通过动物体内试验验证。Nakai等[7]首次研究了噬菌体对黄条(Seriolaaureovittata)幼鱼格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)感染的治疗效果。试验先对黄条腹腔注射格氏乳球菌攻毒，随后立即腹腔注射1.6×107pfu的噬菌体PLgY-16，10 d后病鱼的存活率由10%升至100%，可见噬菌体具有显著治疗效果。随后，噬菌体被陆续尝试用于防治香鱼(Plecoglossusaltivelis)冷水病[8]、大西洋鲑(Salmosalar)杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)感染[9]、斑节对虾(Penaeusmonodon)发光病[10]，以及皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)[11]和仿刺参(Apostichopusjaponicus)弧菌病[12]等，相关代表性研究见表1。

迄今，大多数研究是以人工攻毒感染的动物为模型，再将噬菌体以口服、浸浴、腹腔或肌肉注射等方式给药，后根据动物的发病率或存活率来判断噬菌体的防治效果。如在鱼类养殖中，Park等[13]对香鱼口服变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)攻毒后，立即饲喂PPpW-3、PPpW-4两种噬菌体的混合物，两周后香鱼死亡率从65.0%降至22.5%；Higuera等[14]用5×105cfu/mL鳗弧菌(Vibrioanguillarum)Va PF4对大西洋鲑进行浸浴攻毒，同时按感染复数为1和20的剂量加入噬菌体CHOED，鱼的存活率由7%升至100%。在对虾养殖中，Karunasagar等[10]针对哈维氏弧菌(V.harvey)引起的对虾发光弧菌病，在攻毒后每隔1 d用2×106pfu/mL噬菌体Viha10和Viha8浸浴，斑节对虾幼体存活率与抗生素治疗组相比由65%升至88%。在贝类养殖中，李太武等[11]对皱纹盘鲍足部肌肉注射河流弧菌(V.flauvialis)进行攻毒，同时以感染复数为10的剂量注射噬菌体，7 d后与对照组相比，皱纹盘鲍的死亡率由70%降至20%。总体可见，噬菌体能显著提高攻毒感染动物的存活率，具有较显著的防治效果。

但也有个别研究显示噬菌体对鱼类病害无防治效果。Verner Jeffreys等[9]以被杀鲑气单胞菌攻毒感染的大西洋鲑为模型，将3株噬菌体O、R、B混合制成“鸡尾酒”制剂，再对鱼进行饲喂、浸浴和腹腔注射噬菌体，均未能降低大西洋鲑的死亡率。可见，影响噬菌体体内作用效果的因素较为复杂，对噬菌体治疗失败的原因尚有待深入研究。

表1 噬菌体防治水产养殖动物细菌性疾病的研究Tab.1 Application of bacteriophages in treatment of bacterial diseases in animals in aquaculture

2 噬菌体疗法尚存在的问题及解决策略

2.1 噬菌体的裂解宿主谱窄

噬菌体裂解细菌的作用，具有严格的宿主特异性，一般仅限于细菌分类学上“种”的界限之内，大多噬菌体仅对某种细菌里的某些特定株有裂解作用，这种专一性要求噬菌体在水产养殖中应用时需预先建有能涵盖各种病原菌的噬菌体库，且能够快速诊断出病原及其噬菌体易感性。

目前解决噬菌体裂解谱窄的常见方法是“鸡尾酒”法，即将针对同种宿主菌的几株不同噬菌体混合后联合应用，如用于控制肉制品中李斯特菌(Listera)的LixtexTMP100为6株单增李斯特菌(L.monocytogenes)噬菌体的混合物[24]。在水产养殖中，仿刺参“化皮病”的病原也具有多样性的特点，如灿烂弧菌(V.splendidus)、溶藻弧菌及杀鲑气单胞菌等均曾被证实能引起仿刺参化皮，但目前噬菌体用于仿刺参化皮的研究仅针对弧菌，尚未见将不同宿主的噬菌体混合后使用。

值得注意的是，自然界分离到的少数噬菌体株具有宽谱特性，这在肠杆菌和葡萄球菌噬菌体中较为常见。一些弧菌噬菌体也显示出宽谱特性，如噬菌体KVP40能同时裂解8种弧菌，其中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌和灿烂弧菌等，甚至能跨出“属”的界限裂解鳆发光杆菌(Photobacteriumleiognathid)[25]；与此类似，鳗弧菌噬菌体CHOED也能裂解病海鱼弧菌(V.ordalii)[14]。可见，筛选宽谱噬菌体也是解决噬菌体宿主谱的一种可行方案。

此外，噬菌体的特异性基于其尾丝蛋白与宿主菌表面受体的专一性结合，对噬菌体进行基因工程改造，特别是其尾丝蛋白部分，也能有效拓宽其宿主谱。如T2噬菌体仅能裂解7%的大肠杆菌分离株，利用同源重组的方法将T2尾丝蛋白基因gp37和gp38与另一株宽谱噬菌体IP008替换，这种改造后的T2噬菌体宿主谱明显变宽，能裂解33%的大肠杆菌分离株[26]。

2.2 病原菌易对噬菌体产生抗性

细菌易对噬菌体产生抗性，这可能是限制噬菌体作用效果的关键因素。噬菌体完成一个复制周期需经吸附、核酸注入、核酸复制、基因转录与蛋白质生物合成、装配及释放几个步骤，宿主菌阻碍其中任一步骤即可产生抗性，如阻碍噬菌体吸附、抑制噬菌体核酸注入、切割噬菌体核酸及流产感染系统等[27]。

在体外培养物中，噬菌体抗性菌株在数小时或数日内即可出现。将多株噬菌体混合后的“鸡尾酒”法虽能有效延缓噬菌体抗性菌株的产生，但仍难以完全消除培养物中的宿主菌。与持留菌对抗生素耐药类似[28]，笔者推断细菌群体中存在一小部分生长缓慢、代谢活动弱的亚群，虽未发生基因抗性突变，但对噬菌体不敏感。这些持留菌接种到新的培养基中可再次生长起来，又呈现出大部分细菌能够被噬菌体杀死，仅有一小部分存活下来的情况。

不过在水产动物体内环境下，病原菌会遇到复杂多样的选择性压力，如营养缺乏、其他微生物竞争及宿主免疫防御等，噬菌体抗性菌株并不易出现。Nakai等[7]从经噬菌体处理的黄条体内分离的所有格氏乳球菌对噬菌体PLgY-16依然敏感；与此类似，Park等[13]从经噬菌体处理后但仍然病死的香鱼体内也未分离出噬菌体抗性突变菌株。这也提示体内细菌在没有发生抗性突变的情况下也能逃避噬菌体的裂解，单一应用噬菌体难以完全清除体内病原菌。

值得注意的是，某些细菌的毒力因子也是噬菌体的吸附受体，如脂多糖、外膜蛋白或荚膜等。致病菌株可以通过受体突变缺失或结构变化对噬菌体产生抗性，这时会伴随着毒力下降，或对抗生素更加敏感，表现出进化生物学中的权衡现象。如变形假单胞菌野生分离株对香鱼的半致死剂量为101.2cfu/尾，而噬菌体抗性突变株对香鱼的半致死剂量>104cfu/尾，毒力显著降低，但具体原因并未阐明[13]。Chan等[29]研究发现，噬菌体OMKO1以铜绿假单胞菌外排泵Mex AB-OprM上的外膜通道蛋白OprM为吸附受体，在噬菌体的选择压力下，铜绿假单胞菌OprM基因突变，外排泵功能丧失，导致对几种抗生素类药物的敏感性增加，这为噬菌体与抗生素组合使用提供了理论依据。

2.3 噬菌体的给药途径

水产养殖中噬菌体的给药途径有腹腔或肌肉注射、通过饲料口服以及浸浴，针对一些体表外伤，也有涂抹法[15]。但注射、涂抹给药方式可操作性差，可行的给药途径是通过饲料口服或浸浴。

口服噬菌体首先需要解决胃酸屏障问题。除少数噬菌体(如λ噬菌体)对酸有较强耐酸性外，大部分噬菌体对酸敏感，一般在pH<3.0时迅速失活。与陆生动物相比，鱼的胃液pH相对较高，特别是一些幼鱼，如黄条幼鱼胃液pH在5.2～6.0间变化[7]，口服噬菌体能够稳定穿过胃酸屏障。但对一些胃液酸性较强的鱼类而言[如虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，静息状态下胃液pH为2.7[30]，口服噬菌体易遭胃液破坏而丧失抗菌活性。在陆生动物中，目前解决胃酸屏障的方法有2种:(1)使用抗酸剂中和胃酸，如CaCO3、Mg(OH)2等，或用雷尼替丁和奥美拉唑等药物来抑制胃酸分泌[31]；(2)对噬菌体进行微囊化包埋，Ma等[32-33]曾用静电振动喷嘴—离子络合凝胶法分别制备出海藻酸钙/壳聚糖微球、海藻酸钙/乳清蛋白微球以及掺杂CaCO3无机微粒的海藻酸钙微球，成功用于噬菌体Felix O1和噬菌体K的包埋，有效解决了口服噬菌体在动物胃肠环境中的稳定性问题。这几种微球在水产养殖动物中的应用是笔者所在团队目前正在进行的工作。

口服噬菌体一般主要针对动物胃肠道感染，但噬菌体不能黏附或定殖于动物肠道中，故很快会被排出体外。不过，也有部分噬菌体可穿过动物肠黏膜进入循环系统，如口服变形假单胞菌噬菌体PPpW-3和PPpW-4能进入香鱼循环系统，并转运到达肠、肾、脾等组织器官，消减感染组织中的病原菌；与此类似，口服噬菌体A5/80可以进入大鼠血液循环，不过口服T4却不能[31]。口服噬菌体从动物肠道进入循环系统的机制目前尚未完全阐明，可能是通过类似细菌肠道移位的过程实现，且决定噬菌体能否移位的因素包括多个方面，如噬菌体衣壳蛋白的序列，与肠道免疫细胞的相互作用等[34]。

然而口服给药对处育苗阶段或感染后不摄食的水产养殖动物难以适用，浸浴法是另一种较为理想的给药方式。水体中噬菌体易与目标宿主菌株碰撞吸附，这对控制通过皮肤和鳃组织侵染的水产致病菌更具优势。不过，目前这种方法仅限于实验室环境下封闭水体中的应用，是否适应于大规模开放水域还有待进一步研究。

2.4 噬菌体的给药剂量

噬菌体能够自我复制增殖，若噬菌体在一个裂解周期内产生200个子代病毒颗粒，那么理论上它将以200n方式进行指数增殖[35]，这意味着单次给药即可实现理想治疗效果；而抗生素类小分子药物由于体内的代谢消除作用[36-37]，一般需重复多次给药方可达到药效。Smith等[38]曾以经大肠杆菌(O18ac:H7:K1)攻毒感染的小鼠为模型，证实了单剂量噬菌体治疗效果显著优于多剂量的抗生素，其中包括氨苄青霉素、四环素、氯霉素和磺胺异恶唑。

但很多研究发现，噬菌体感染复数越大，对动物保护效果愈佳，在低剂量时常无防治效果。Zhang等[12]将PVA1和PVA2两株噬菌体混合后，对仿刺参进行腹腔注射，在感染复数分别为10、1、0.1时，可将攻毒感染仿刺参的存活率由3%分别提升至73%、50%和47%。Madsen等[39]向虹鳟幼苗腹腔注射104cfu/尾嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)，再腹腔注射104pfu/尾噬菌体FpV-9，未能提高鱼的存活率。这些研究均表明，噬菌体在低剂量给药时无治疗效果，可能的解释是体内环境下的大多数宿主细菌处于生长缓慢或停滞的生理状态，噬菌体对其吸附感染能力下降，仅能通过初级感染方式完成杀菌作用。可见，噬菌体合理给药剂量目前仍难以确定，而这有待于未来噬菌体在不同水产动物体内药代动力学特征的阐明。

2.5 噬菌体的给药时间

噬菌体的治疗效果与其给药时间密切相关，一般动物感染后噬菌体制剂应用越早，存活率越高。在动物感染后期，噬菌体的治疗效果很有限。Nakai等[7]对黄条腹腔注射格氏乳球菌攻毒，并于攻毒后0、1、24 h分别腹腔注射1.6×107pfu/尾剂量的噬菌体PLgY-16进行治疗，10 d内感染鱼的存活率分别为100%、80%和50%。与此类似，卤虫(Artemiafranciscana)无节幼体被副溶血性弧菌感染后立即加入噬菌体Vpms1，其存活率为88%；但攻毒后延迟5 h加入噬菌体，卤虫存活率则仅为5.8%[40]。近年Roach等[41]提出了“免疫噬菌体协同作用”的概念，并证实噬菌体治疗小鼠铜绿假单胞菌感染需要其非特异免疫系统的协助。据此，笔者推测动物自身的免疫系统可能对噬菌体防治效果发挥关键作用，在感染后期，动物免疫功能低下或受损，噬菌体治疗难以奏效。

此外，噬菌体病毒颗粒难以进入动物细胞内，而在感染后期，某些病原菌能侵入胞内逃避噬菌体的裂解，如迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、沙门氏菌(Salmonella)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等。目前一种可行的解决策略是以减毒宿主菌作为载体将噬菌体导入胞内，如以减毒耻垢分支杆菌(M.smegmatis)为载体，携带噬菌体TM4进入巨噬细胞，可显著降低小鼠脾脏巨噬细胞内的分支杆菌数量[42]，但这种方法还有待于在其他噬菌体及宿主系统中验证。

2.6 噬菌体在水产动物中的药代动力学特征尚未阐明

噬菌体是一种依赖宿主菌、能自我复制的病毒颗粒，它在鱼体内的吸收分布规律及代谢动力学特征目前尚未完全阐明。与抗生素小分子药物相比，噬菌体在动物体内抗菌作用过程中具有两个显著特点：一是噬菌体能够在体内自我复制增殖；二是噬菌体作为异源物质具有免疫原性，可能会刺激鱼机体产生免疫反应，产生的抗体可能会对噬菌体产生消除作用。这两个特征致使噬菌体的体内吸收分布规律及代谢动力学特征难以被准确描述。Payne等[43]建立了预测噬菌体体内群体动力学的数学模型，指出噬菌体初始给药剂量、治疗时间及宿主菌密度是决定治疗成败的关键，但此模型是基于噬菌体的体外生长数据，是否适用于动物体内尚有待进一步验证。

与高等脊椎动物相似，鱼类免疫组织包括分布于胸腺、脾脏等器官中的系统淋巴组织和存在于肠、鳃等器官中的黏膜淋巴组织[44]。对哺乳动物的研究发现，腹腔注射噬菌体会刺激机体产生抗体，且影响噬菌体的体内裂菌效果[45]。最近研究发现，口服噬菌体能刺激小鼠肠黏膜免疫应答产生分泌型抗体IgA，显著降低了噬菌体活性[46]。此外，机体网状内皮系统也能将噬菌体从循环系统中清除[47]。但鱼机体的免疫反应对体内噬菌体的吸收分布及消除过程的影响还是个未知问题。有研究发现，香鱼口服或肌内注射变形假单胞菌噬菌体PPpW-3、PPpW-4后，血清中均未检出能中和噬菌体的抗体，其原因可能是这些噬菌体分离株对香鱼的免疫原性低，或是给药剂量过低[13]。

同种宿主不同噬菌体间的免疫原性相差很大，如大肠杆菌T4噬菌体免疫原性大于T1和T5[48]，这提示，可以针对某特定宿主菌筛选出免疫原性较低的噬菌体。Merril等[47]就曾采用体内连续传代的方法，筛选出能在循环系统长期存活的噬菌体突变株，这为解决噬菌体免疫原性问题提供了思路。此外，目前蛋白类药物可通过聚乙二醇修饰的方法降低免疫原性，从而延长药物在体内的半衰期；与此类似，Kim等[49]用单甲氧基聚乙二醇修饰噬菌体后，也能有效延长噬菌体在血液中的循环时间并阻止其被免疫系统快速清除。

值得提出的是，对一些缺乏特异性免疫系统的低等水产养殖动物，如仿刺参，噬菌体应用时受宿主免疫系统影响较小。Li等[50]研究发现，噬菌体能通过浸浴途径进入仿刺参体腔液并较长时间滞留，且活性不受超氧化物歧化酶和溶菌酶等非特异性免疫因子的影响。

2.7 噬菌体应用的安全性问题

噬菌体在自然界中无处不在，凡有原核生物活动的地方几乎都发现有相应的噬菌体存在，据估计地球生物圈中噬菌体数目高达1030～1032个[51]，尤其以海洋中的噬菌体数目和种类最多，如在表层海水中噬菌体的丰度达到近107个/mL，是细菌丰度的5～25倍[52]。此外，人和动物体内就寄居着各种噬菌体，如人的胃肠道、尿道、皮肤以及口腔中均有噬菌体存在[53-54]。因此，噬菌体是人或动物体内的正常共栖生物体，安全性毋庸置疑。目前已有多个噬菌体产品被美国食品药品监督管理局认定为公认安全级产品，如荷兰Micreos Food Safety公司的ListexTMP100[24]，美国Intralytix公司的SalmoFreshTM等[55]。

但是，部分温和噬菌体携带一些编码毒力因子的结构基因，可整合到宿主菌的基因组上，赋予其产毒能力，如霍乱弧菌(V.cholerae)和拟态弧菌(V.mimicus)的主要毒力因子霍乱毒素就是由丝状噬菌体CTXΦ携带的ctxAB基因所编码[56]；且溶源性霍乱弧菌中的前噬菌体CTXΦ在受到外界理化因素诱导后，可脱离宿主产生成熟的噬菌体颗粒CTXΦ，它又会侵染新的无毒菌株，这样就造成了ctxAB基因在菌株间的水平扩散。同样，目前还在哈维弧菌和副溶血弧菌中发现有溶源性噬菌体，且哈维弧菌对斑节对虾的致病性也与噬菌体相关[57]。另外，温和噬菌体还通过转导作用传递抗生素耐药基因[58]。因此，在应用噬菌体之前需对噬菌体的基因组进行测序，以排除噬菌体携带毒素基因或抗生素耐药基因的可能性；同时，也可通过噬菌体是否携带阻遏蛋白和整合酶基因来初步判断其溶源性。

目前可采用基因工程手段将温和噬菌体改造为烈性噬菌体。Dedrick等[59]为侵染脓肿分枝杆菌(M.abscessus)的温和噬菌体，通过基因工程手段将其阻遏蛋白基因gene45敲除后，使其丧失溶源能力而变为烈性噬菌体；此株噬菌体最近被首次用来治疗人分枝杆菌感染，可让患者症状明显缓解[60]。

噬菌体将体内感染病灶处革兰氏阴性细菌裂解后，短时间内引起细胞外膜层内毒素的大量释放，这对哺乳动物而言，存在产生内毒素血症的风险。在水产养殖中，脂多糖常被用来提高鱼类的非特异免疫力，但超过安全剂量时同样对水产养殖动物具有较强毒性作用[61]。Verner Jeffreys等[9]给大西洋鲑腹腔注射噬菌体悬液，其中内毒素含量达106～107EU/mL，并未发现对鱼产生不良影响，这可能是由于不同菌种来源的内毒素性质不同，且不同水产动物对内毒素的敏感性也存在差异。

一些噬菌体突变株能感染杀死细菌，但未引起细胞裂解。如T4噬菌体表达穿孔素的基因t发生琥珀突变后(此突变株命名为LysD)，穿孔素不能正常表达，无法在细胞膜上形成跨膜孔，这样裂解酶不能穿过细胞膜到达肽聚糖层发挥溶菌作用，也就避免了内毒素的释放[62]。噬菌体LysD能有效治疗小鼠大肠杆菌性腹膜炎，并降低炎症因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的水平，这为一些水产用噬菌体的基因工程改造提供了新思路。

3 结论与展望

为适应我国渔业转方式、调结构的发展要求，并从根本上解决水产品的质量安全问题，2017年我国农业部开始在部分地区实施“渔药减量行动”，着力推进水生动物病害防控方式向绿色、生态和环保的方向转变。在此背景下，噬菌体作为抗生素替代品应用于水产养殖以显示出其独特优势和巨大潜力。但若将噬菌体像抗生素一样规模化推广使用，仍有诸多问题需要解决。如噬菌体在不同水产动物体内的药代动力学特征亟需阐明，以科学确定噬菌体的给药方式、给药剂量和给药时间；噬菌体是否会介导毒力或抗生素耐药基因转移到非靶细菌上。噬菌体若作为生物制品投入市场，需要通过国家药监部门严格的监管批准，同时也要考虑消费者对噬菌体处理产品的接受程度。