斑点叉尾败血症的病原学与病理组织学观察

李成伟，王 均，刘嘉惠，耿 毅

( 1.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130； 2.内江师范学院，四川 内江 641100；3.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130 )

1 材料与方法

1.1 试验对象

1.2 病原菌的分离与镜检

1.3 人工感染试验

1.4 分离菌株理化特性及药敏试验

将纯化后的分离菌株接种于微量生化管中，28 ℃下培养24 h，参考《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化特性鉴定。采用药敏纸片法对分离菌株进行药物敏感性试验，试验药物包括：卡那霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、多黏菌素B、阿奇霉素等27种药物。

1.5 16S rRNA和gyrB基因扩增及序列测定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA作为PCR模板。采用细菌16S rRNA和gyrB基因通用引物进行PCR扩增。扩增产物纯化后送生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定。

将分离菌株的16S rRNA基因序列和gyrB基因扩增序列于GenBank中已知核酸序列进行Blastn分析，调出与该序列相关性较高的核酸序列，用MEGA 6.0软件包中的邻接法构建系统进化树，重复抽样1000次分析系统树各分枝的置信度。

1.6 病理组织学观察

2 结 果

2.1 病鱼临床症状

病鱼头部、鳍条基部、眼球严重出血，泄殖孔红肿，鳃丝肿胀、充血，剖解后各内脏器官广泛性出血：脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、鱼鳔、肠道严重出血，肝脏肿大，肠道内有血样黏液，内有少量或无食物，个别病鱼带有血样腹水(图1)。

2.2 病原菌的分离与镜检

病鱼经采血制作血涂片，鳃丝、体表黏液和肠道内容物压片后，在显微镜下观察，未见寄生虫。在28 ℃培养24 h后，从病鱼的肝脏、肾脏中分离得到一株优势菌，表现为边缘齐整、圆形光滑、中间较凸起、淡黄色的菌落，革兰氏染色显示为阴性、两端钝圆无芽孢的短杆菌，将该菌株编号为CW。

图1 自然发病鱼症状Fig.1 Symptoms of naturally diseased channel catfish I. punctatusa.头部、眼球、鳍条基部充血； b.腹腔内广泛性出血.a.congestion of head, eyeball and fin base; b.extensive hemorrage of viscera.

2.3 人工感染试验

表1 菌株CW人工感染试验结果Tab.1 Artificial infection results of the strain CW

2.4 理化特性结果

生理生化试验结果表明，菌株CW能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖，但纤维二糖、阿拉伯糖、乳糖、尿素酶呈阴性；赖氨酸、吲哚试验、MR试验、VP试验、氧化酶试验呈阳性，各项生理生化指标与《伯杰氏细菌学手册》中所列的嗜水气单胞菌基本相符。

2.5 16S rRNA和gyrB基因序列及系统发育树分析

以分离菌株CW的DNA为模板，用细菌16S rRNA和gyrB基因通用引物进行PCR扩增，经电泳检测和凝胶成像系统后，16S rRNA基因约于1500 bp得到其目的条带，gyrB基因约于1300 bp得到其目的条带(图2)。经测序得到16S rRNA序列1423 bp(GenBank登录号：MN475912)，gyrB基因1143 bp(GenBank登录号：MN504786)。

系统发育树结果显示，在16S rRNA序列、gyrB序列上，菌株CW均分别聚在嗜水气单胞菌的分支上(图3、图4)。结合生理生化鉴定结果，判定菌株CW为嗜水气单胞菌。

图2 菌株CW的16S rRNA和gyrB基因检测Fig.2 PCR products of 16S rRNA and gyrB gene of the strain CWM.Marker D2000； 1.16S rRNA； 2.gyrB.

图3 菌株CW的16S rRNA系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the strain CW based on 16s rRNA

图4 菌株CW的gyrB基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the strain CW based on gyrB sequences

2.6 药物敏感性试验

药敏试验结果显示(表2)，嗜水气单胞菌CW对氧氟沙星、诺氟沙星、吡哌酸、妥布霉素敏感(S)，对卡那霉素、多黏菌素B、阿奇霉素中度敏感(I)，对氨苄西林、四环素、多西环素等20种抗生素耐药(R)。

表2 嗜水气单胞菌CW药物敏感试验Tab.2 Antibiotic susceptibility test of the strain CW

2.7 病理组织学观察

病理组织学观察结果显示，肝小叶中央静脉淤血(图5a)，肝血窦受压，体积缩小，狄氏间隙明显增宽(图5b)，肝细胞肿胀，广泛性颗粒变性、空泡变性，局灶性肝细胞溶解，结构均质化，部分肝小叶出现坏死灶(图5c)；肾小管上皮广泛性颗粒与空泡变性，其间发生坏死、脱落，整个肾小管结构坏死(图5d)，肾间质淤血、出血，组织增生，大量淋巴细胞浸润(图5e)；脾脏广泛性淤血，其间有淋巴细胞浸润(图5f)，淋巴细胞坏死，数量减少，淤血、出血，大量含铁血黄素沉积(图5g)；肠黏膜上皮细胞肿胀，局灶性区域坏死脱落(图5h)，固有膜与黏膜下层疏松、水肿，有大量嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润(图5i)；鳃小叶细胞肿胀，局部增生，局部区域鳃小叶上皮坏死脱落，血管裸露，甚至整个小叶坏死溶解、结构消失，并有大量嗜酸性细胞浸润(图5j)；心肌纤维肿胀，横纹消失，颗粒变性、空泡变性，局部肌纤维坏死、断裂或溶解，并有大量淋巴细胞与噬中性粒细胞浸润(图5k)；眼球脉络膜充血、出血(图5l)。

图5 感染嗜水气单胞菌病斑点叉尾的组织病理损伤Fig.5 The pathohistological observation of channel catfish I. punctatus infected by A. hydrophilaa.肝小叶中央静脉淤血(→)； b.狄氏间隙增宽(→)； c.肝细胞肿胀(→)，广泛颗粒变性、空泡变性(▲)； d.肾小管坏死溶解(→)，肾间质淤血、出血(▲)； e.淋巴细胞浸润(→)； f.脾脏广泛性淤血(→)，淋巴细胞浸润(▲)； g.淋巴细胞坏死，数量减少(→)，含铁血黄素沉积(▲)； h.肠黏膜上皮细胞坏死脱落(→)； i.肠黏膜下层嗜酸性细胞(→)、淋巴细胞浸润(▲)； j.鳃小叶上皮细胞脱落(→)，嗜酸性细胞浸润(▲)； k.心肌中性粒细胞(→)、淋巴细胞浸润(▲)； l.眼球脉络膜充血、出血(→).a.congestion of central vein of hepatic lobule(→)； b.widening and congestion of the Dickel space(→)； c.hepatocellular swelling(→)，denaturation of granules and vacuoles(▲)； d.necrolysis of renal tubules(→)，renal interstitial congestion and hemorrhage(▲)； e.lymphocyte infiltration(→)；f.extensive congestion of spleen(→)，lymphocyte infiltration(▲)； g.lymphocyte necrosis and decrease in number (→)，hemosiderin deposition(▲)； h.necrosis and exfoliation of intestinal epithelial cells(→)； i.eosinophils in intestinal submucosa(→),lymphocyte infiltration (▲)； j.gill lamellae epithelial cell exfoliation(→)，eosinophil infiltration(▲)； k.myocardial centriomyocytes(→),lymphocyte infiltration (▲)； l.eyeball choroid shows diffusive hemorrhage and hyperemia(→).

3 讨 论

3.1 嗜水气单胞菌感染鱼类的临床表现

3.2 病理损伤与发病机制

嗜水气单胞菌是典型的条件性致病菌，平时和水体中的鱼类共存而不发病，当水温达到25 ℃时，水环境中菌体大量繁殖，是感染鱼类的诱因，本病例的养殖池塘5月气温急剧升高，病原菌复苏，同时池塘3年未清淤，氨氮、亚硝态氮均严重超标(氨氮1.5 mg/L，亚硝态氮0.5 mg/L)，鱼体免疫力下降，暴发疾病。本试验中肝静脉、心室、脾脏、肠道黏膜下层出现大量炎性细胞浸润，这是鱼类细菌感染后出现的积极免疫应答表现；同时该菌在宿主体内大量繁殖，分泌毒素(主要有溶血素、细胞毒素、肠毒素)经血液循环到达各组织器官，这些毒素均具有很强的溶血性、细胞毒性和肠毒性[18]，造成红细胞裂解、毛细血管损伤、通透性增大，红细胞游走出血管外，因此本试验表现出肾间质、脾脏、眼球出血的病理变化，同时毒素引起肝、肾、脾组织细胞损伤，由颗粒变性、空泡变性到后期局灶性坏死，肠黏膜脱落，这与周碧君等[9,11]的研究结果一致。

3.3 治疗与预防

由于抗生素使用不合理、质粒及耐药基因的水平转移等因素，近年来鱼源嗜水气单胞菌多重耐药现象普遍，表现出耐药谱广、耐药率高的特点[19-20]，本试验结果表明，只有4种(两类)药物对嗜水气单胞菌CW敏感，同样表现出极高的耐药谱。氧氟沙星、诺氟沙星、吡哌酸3种敏感药物为喹诺酮类，相关研究表明，嗜水气单胞菌对该类药物具有极高的敏感性[21-22]。敏感药物中的氧氟沙星、诺氟沙星、妥布霉素这3种药物均为禁用兽药，则吡哌酸成为唯一的选择，反观该地区临床用药，未针对疾病进一步诊断就盲目使用抗生素大剂量内服，若无明显效果则换另一种抗生素，延误疾病治疗，造成不必要损失，同时也增加了环境中嗜水气单胞菌的获得性耐药，形成常用药物完全无效现象，为当前疾病的治疗带来了很大困难。临床上应结合药敏试验结果科学用药，同时在养殖过程中注重养殖水环境的调节，使用有益微生物竞争抑制病原菌，预防疾病的发生，保证水产品的健康安全。

4 结 论