远志地上部位芒果苷和总皂苷含量测定研究

魏 巍 刘雅晴 田 盛 吴雪梅 王海波

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

中药远志最早记载于《神农本草经》，列为上品，并被视为养命要药，其性温，味苦、辛，具有安神益智、祛痰、消肿的功效。其来源为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld．和卵叶远志P.sibiricaL.的干燥根[1]。从远志中可分离得到诸多活性成分，以三萜皂苷类、酮类和寡糖酯类为主要活性成分[2]，但其地上部位常常作为废料丢弃。为更好利用远志药材资源，进一步考察远志主要药效成分在其地上部位的分布及含量情况，对其地上部位花、茎、叶进行了成分及含量测定分析。研究发现其地上部位含有芒果苷，是一种四羟基酮碳苷，属双苯吡酮类化合物。芒果苷具有抗病毒、抗癌、免疫调节、保肝利胆、止咳平喘等多种生物活性[3-5]。还可用于高血压的治疗，具有降压及保护炎症损伤等作用[6]。为综合利用远志植株资源，本研究采用HPLC液相色谱法、比色法，对远志地上部位的芒果苷及总皂苷含量进行测定，为远志非药用部分的开发利用提供参考。

1 材料与试剂

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，RPL-D2000柱温箱(大连日普利科技仪器有限公司)，Cculab Alc-110.4分析天平(德国Sartorius 公司)、CP225D分析天平(德国Sartorius 公司)、TD2002C型电子天平(天津天马衡基仪器有限公司)、U3010 紫外分光光度计(日本日立公司)、HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.2 试剂与试药 细叶远志皂苷对照品(批号：141027)、芒果苷对照品(批号：160228)购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度≥98.5%，甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)，乙腈(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团公司)，盐酸(分析纯，西陇化工股份有限公司)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇、盐酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，远志地上部位样品来源于辽宁中医药大学药学院药用资源苗圃园(辽宁大连，二年期，11月份采收)，见表1。经辽宁中医药大学许亮教授、邸学高级实验师鉴定，为远志科植物远志(P.tenuifoliaWilld.)的地上部位。

表1 远志植株来源情况

2 方法与结果

2.1 HPLC测定芒果苷含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.05%磷酸乙腈溶液(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脱：0～12 min: 10%～15%(A), 25～32 min: 22%～45%(A),35 min:12%(A)，柱温：35 ℃，检测波长：258 nm，流速1.0 mL/min;进样量：10 μL。色谱图如图1所示。

A.对照品；B.供试品；1.芒果苷图1 高效液相色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芒果苷对照品适量，加甲醇配制成每1 mL含1.25 mg的对照品溶液，作为对照品储备液备用。精密称取对照品储备液适量，加甲醇配制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取远志地上部位药材样品粉末0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，超声处理二次，每次25 min，滤过，合并滤液，减压浓缩至5 mL左右，定量转移至10 mL量瓶中，加50%乙醇定容至刻度。滤过，续滤液用微孔滤膜(0.45μm)过滤，即得。

2.1.4 线性范围考察 分别精密吸取芒果苷对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL进样，以色谱峰面积Y对芒果苷对照品质量X进行回归处理，得回归方程为：Y=233.69X+33.60，r=0.9991。结果表明，芒果苷在0.2～1.2 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度实验 精密吸取芒果苷对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，测得芒果苷色谱峰面积RSD值为2.0%，仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性实验 精密吸取同一份远志地上部位供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件，分别于配制后的0、1、2、3、4、6、8、10 h进样分析，测得色谱峰面积的RSD值为2.4%。结果表明，供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.1.7 重现性实验 按照“2.1.3”项下方法制备远志地上部位供试品溶液6份，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，测得RSD值为2.4%。方法重现性良好。

2.1.8 加样回收率实验 采用加样回收率法，精密称取已知含量的同一份远志地上部位药材0.05 g，置具塞瓶中，加入相当量的芒果苷对照品储备液。按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算其加样回收率。结果表明本品的平均回收率为104.6%，RSD为2.8%，符合相关规定。

2.1.9 样品含量测定，按“2.1.1”项下色谱条件测定6批样品，结果见表2。

表2 远志地上部位芒果苷含量测定结果表

2.2 比色法测定总皂苷含量

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定细叶远志皂苷对照品适量，加甲醇配制成每1 mL含0.01 mg的对照品溶液，备用。

2.2.2 样品测定 精密吸取对照品溶液及供试品溶液适量于试管中，再精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，密塞，60℃水浴加热15 min,取出，冷却5 min，加入5 mL冰醋酸稀释，摇匀，静置15 min，576 nm处测定吸光度。

2.2.3 供试品溶液的制备 取远志地上部位样品0.1 g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75%乙醇5 mL，超声处理50 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.2.4 测定波长的选择 精密吸取对照品溶液及供试品溶液适量，以相应试剂为空白溶液；按“2.2.2”项下测定方法，于400～800 nm范围内进行扫描。结果表明，对照品与供试品在576 nm处有最大吸收，故选择576 nm为测定波长。

2.2.5 标准曲线的绘制 分别精密吸取细叶远志皂苷对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按“2.2.2”项下测定方法进行测定，以吸光度Y对细叶远志皂苷对照品质量X进行回归处理，得回归方程为：Y=0.0151X-0.0947，r=0.9896。结果表明，细叶远志皂苷在0.05～0.4 μg范围内线性关系良好。

2.2.6 总皂苷含量测定结果 按“2.2.2”项下测定方法测定6批样品，结果见表3。

表3 远志地上部位细叶远志皂苷含量测定结果表

3 结论与讨论

3.1 色谱条件的优化 芒果苷为多羟基酚类化合物，在色谱柱中拖尾严重，但在流动相中加入酸可以明显减轻该现象，经优化，发现使用0.05% 磷酸溶液作为水相时能够较好地抑制芒果苷拖尾现象并提高了检测的灵敏度。此外，本实验采用了含磷酸乙腈—水溶液梯度洗脱，操作简便，能够实现远志地上部分的快速检测。在该色谱条件下，芒果苷出峰时间为15 min，测定方法简便、快速。经比较258 nm、320 nm两个吸收波长，发现258 nm处有较强的紫外吸收，且峰形较好，基线平稳，分离度较高，故选择258 nm作为检测波长。

3.2 远志地上部位利用 远志在安神益智、交通心肾上的功效良好，临床应用十分广泛，但随着远志需求量日益增加及野生资源日益减少，远志在市场中的供需矛盾日益显现。且栽培远志因栽培期长，产量不大，价格较高，极大影响了远志成分及提取物的提取生产。而远志根茎入药用，地上部位常被丢弃。远志地上部位来源广，价格便宜，尚未得到充分的利用。因此，远志地上部位的开发逐渐受到关注。本研究结果显示，远志的地上部位含有的芒果苷及总皂苷成分，平均含量分别为8.74 mg/g和0.53 mg/g。以芒果苷开发为例，其降血糖、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗癌等作用，在临床上可用于糖尿病、急性支气管炎、癌症等疾病的预防与治疗，抗氧化作用则可用于抗衰老的保健品或护肤品的研究开发。皂苷类成分是远志主要活性成分，在祛痰镇咳、保护神经元、改善学习记忆以及保护心脑血管等方具有良好的药理活性。以细叶远志皂苷为例，其在实验中被证实可通过抗Aβ沉积、抗Tau蛋白磷酸化、抑制炎症介质的产生等生理活性达到抗痴呆及神经保护方面的作用，具有良好的应用前景[7-8]。药用植物资源的综合利用也已成为中药资源可持续发展的趋势，对远志地上部位的药用成分含量研究，能够为更好的综合利用远志药材资源提供研究支持。