板蓝根颗粒中需氧菌总数检验能力验证试验分析

李彦陶

（长治市食品药品检验所 山西长治 046000）

1 前言

能力验证是通过实验室间比较，依照事先制定的准则，来评估实验室能力的活动[1]。 具体开展方式为：能力验证计划实施机构向参加实验室发送样品，要求实验室于规定时间内进行检验并上报检测结果，再将所有实验室结果展开统计、分析，根据各实验室结果的一致性， 判断实验室对指定项目的检测能力。能力验证实质上是一种自我评估手段。为了更加准确地获得能力验证结果， 本试验组综合多种方式实施同步检测。本研究主要是在能力验证时，利用直接倾注法、陶瓦盖替代平皿盖法、添加2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法进行同步试验，并运用提前观察、 增加观察频率与培养时间， 以提高计数准确性，获取较为准确的试验结果进行上报。

需氧菌总数测定为一般微生物实验室应具备的基础检测能力，积极参与该项目能力验证，可规范检测人员操作行为，便于实验室自我评价，证明其数据的可信度、准确性，发现并纠正自身问题，促进实验室后期检测工作顺利开展。鉴于此，本文对板蓝根颗粒中需氧菌总数检验能力验证试验展开探究。

2 材料与方法

2.1 测试样品

样品1：大肠埃希菌定量菌株（北京陆桥技术股份有限公司，批号：190213）；样品2：板蓝根颗粒需氧菌总数能力验证样品（中国食品药品检定研究院，编号：NIFDC-PT-196）。

2.2 培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司，批号：181221）；氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术股份有限公司；批号：180820）。

2.3 仪器设备

SX-700 型高压蒸汽灭菌器、SPX-150 生化培养箱、可调移液器（艾本德中国有限公司）；生物安全柜（HFSafe-1200）；漩涡混匀器（德国 IKA 公司）。

2.4 试验方法

参照《NIFDC-PT-196 板蓝根粒需氧菌总数能力验证作业指导书》，用已知阳性菌-大肠埃希菌作为试验菌开展试验。

2.5 样品1 的处理

2.5.1 溶液稀释

按照验证指导书对样品1 进行前处理，在生物安全柜内将样品制成1∶10 溶液，每组分别吸取1 mL溶液放于平皿内，放入冷却至45℃的平板计数琼脂，摇匀。 待培养基凝固后，翻转平皿，在33℃下培养72h 后，取出计数。 同时，将样品稀释液作为空白对照。

2.5.2 稀释后样品溶液移取处理方法比较

A 组：以移液管来取样；B 组：以移液枪取样；C 组：覆盖陶瓦盖；D 组：未覆盖陶瓦盖；E 组：不添加1%TTC，F 组：添加 1%TTC；M 组：取 2 个平行样；N 组：取5 个平行样。

2.6 样品2 的处理

2.6.1 溶液稀释

依照验证指导书对样品2 进行前处理，在生物安全柜中打开板蓝根铝塑袋，整体转移到90 mL 灭菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，调制成1∶10 溶液，保证样品分析均匀。

2.6.2 检测方法

参照《中华人民共和国药典》（2015 版）四部通则中“1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”章节内的平皿法（倾注法），在平皿内吸取1 mL 溶液，倾入冷却至45℃的平板计数琼脂，充分摇匀。 待培养基凝固后，翻转平皿，在33℃条件下培养72 h，而后取出计数。 同时，以样品稀释液作为空白对照。

3 结果

3.1 移液工具的影响

阳性菌对照组的参考值为350 cfu/mL。 应用不同移液工具进行试验，用移液枪移取的B 组样品平均计数结果更接近于参考值，并且每皿结果更平行，计数结果详见表1。

3.2 陶瓦盖应用情况的影响

阳性菌对照组的参考值为350 cfu/mL。 C 组与D 组的结果差异并不显著，由此可见，加或不加陶瓦盖的2 组样品计数结果没有明显差别，说明试验菌比较稳定时，加或不加陶瓦盖对试验结果影响不明显。但对蔓延菌进行计数时，建议加陶瓦盖，计数结果详见表2。

表1 不同移液工具所得值（单位：cfu/mL）

表2 陶瓦盖应用情况对计数结果的影响（单位：cfu/mL）

3.3 是否添加TTC 的影响

阳性菌对照组的参考值为350 cfu/mL。 E 组与F 组的计数情况差异不显著，但F 组平均计数结果更接近于参考值，并且每皿结果更平行，计数结果详见表3。

表3 是否添加TTC 的影响（单位：cfu/mL）

3.4 取平行样数量的影响

阳性菌对照组的参考值为350 cfu/mL。 与M 组相比，N 组所得的结果与参考值更接近，具体计数结果详见表4。

表4 取平行样数量的影响（单位：cfu/mL）

3.5 结论

从3.1～3.4 的结果可推导出，应用移液枪移取样品，多选取几个平行样，实施振摇，并可加陶瓦盖或1%TTC，均可有效限制蔓延菌生长，从而提高上报数据的准确性。

3.6 样品2 的检测结果分析

鉴于3.5 得出的结论，为保证需氧菌总数检验结果符合评价标准，在开展样品2 检测时，选用移液枪取样，设置多个平行样，加和不加陶瓦盖，添加和不添加1%TTC。 经过比较结果，样品2 的计数结果详见表5。

表5 样品2 需氧菌总数计数结果表（单位：cfu/g）

4 能力验证结果与分析

由能力验证组织结构对样品检测结果进行评价，计算剔除离群值数据，对数中位值为2.79，依照结果评价原则，以下范围即为满足：结果对数值满意范围：2.29～3.29，报告值满意范围：195～1950 cfu/g。

本实验室计算对数值为2.81，需氧菌总数报告值为650 cfu/g，根据结果评定原则，为满意结果。

5 讨论

能力验证是保障实验室维持高检测与校准水平而对其能力进行确认、监督、考核的一种验证活动[2]。参加能力验证计划，可为实验室提供其出具数据有效性、可靠性的客观证据[3]。 另外，能力验证还可帮助实验室发现自身存在的问题， 有助于其自身管理质量的持续性改进，对其长远、良好发展具有重要意义。

为保障能力验证顺利开展，实验室应严格按照作业指导书复苏样品进行试验。 经休眠的微生物通常需要一段时间方可恢复其生物学特征，因此样品复苏不均匀或不彻底均会干扰到试验结果。 实验室应严格遵守组织方作业指导书内明确要求实施预处理。 复苏后，立即送检样品，避免在放置期间由于环境或其他因素导致菌体大量死亡，进而影响最终检测结果[4]。

对此，笔者根据既往能力验证过程中存在的问题，认为应从以下5 个方面来控制能力验证的水平：（1）提高检测人员技术水平。保证检测人员具有生物专业背景， 要求其准确掌握无菌操作技术原则和国家相关标准，并规范其行为[5]。 同时，定期对实验室检测人员展开专业培训，内容包括样品的抽取、接收、识别等，并向其科普试验检测要求、最新检测方法应用标准、内部质控参考值、无菌操作技术要点等，以提高其专业知识掌握度。 现场指导检测人员部分操作，并对其错误行为予以纠正，规范其操作行为，以避免因人为原因导致的试验误差。（2）仪器设备质量控制。 在采购仪器设备时，应尽量选择特异性、敏感性、进度较高且技术原理先进的仪器设备，以降低检测误差。因菌落总数测定属于定量检测，仪器设备管理质量会直接影响测定结果。因此，检测前应对设备实施校准与检定，确保其功能完好后，再开展测定工作[6]。 另外，根据不同仪器设备要求，合理制定清洁、维修计划，定期记录各仪器设备运行情况，以减小仪器设备带来的误差，便于后期寻找问题。（3）合理选择检测方法。参照组织方提供的检验方法进行检测，为提升检测准确性，避免蔓延菌干扰，为国家标准方法提供科学参考、对照，可同时应用多种方法，如陶瓦盖替代平皿盖法、添加 TTC 法等，开展测试。 （4）加强时间管理。 由于微生物一般是以二分裂方式进行无性繁殖，且繁殖速度较快，多数细菌约20～30 min便可繁殖一代，故而在开展菌落总数能力验证时，应合理控制检测时间，通常要求在15 min 内完成。 样本培养过程中，因蔓延菌生长速度较快，为避免蔓延菌覆盖其他细菌菌落影响到计数，可事先观察、计数。 适当增加培养时间，以防止生长迟缓的菌落漏检。（5）环境管理。菌落总数能力验证过程中可能会受到温度因素影响，检测过程中，应根据试验要求，合理控制培养温度、时间，强化试验条件管理，以保证临床检测结果。

近年来，由于社会经济的发展，客户对实验室要求也随之增高，能力验证不仅是一种有效的质量控制手段，也是提高客户对实验室认可、信任的一种方式。此外，能力验证还可维持实验室高管理、高检测水平，为客户提供准确的检验结果，从而提升实验室核心竞争力，促进其长远发展。

但在实验室开展能力验证的过程中，会受到如样品、溶液稀释、复苏、加样等诸多因素的影响，从而干预整体检测结果。根据以上影响因素，实验室应不断提升实验室检测人员专业能力，保证仪器设备质量，根据样品检测需要，合理选择检测方法，并强化时间、环境管理，以提高最终分析结果的准确性。