高效液相色谱法测定饲料及饲料添加剂中的维生素B12

李海燕

（泰安市食品药品检验检测研究院 山东泰安 271000）

1 前言

维生素B12又被称为钴胺素，这种物质会对机体的正常造血功能产生积极作用，同时也是机体健康成长和确保神经系统正常的必需元素[1]。 机体所需的维生素B12相对较少，从医学角度而言，每日的维生素B12补充量保持在2.4 μg 即可。维生素B12是一种多环系化合物，含有三价钴，同时维生素B12也是诸多维生素中仅有的含有金属离子的水溶性物质，其外在形态为针状结晶，颜色为浅红色。 维生素B12的主要功能是帮助生物体的骨髓制造红细胞，其主要来源是动物性的食品，例如，奶酪和牛奶以及动物的肝脏等。若人体内缺少维生素B12，将会出现贫血、恶心等症状。 人体对维生素B12的需求量并非很高，在添加维生素的功能性饮料当中， 维生素B12的含量仅为0.01 μg/kg。 含量甚微是维生素B12检测工作所面临的难点[2]。

HPLC 作为一种新型的分离和分析技术，是基于液相色谱法（LC）发展起来的。 LC 分析速度慢，并且分离效率不高[3]。 出现这种现象的原因在于其使用的粗颗粒固定相存在填充不均匀的现象。 随着科学技术的发展，新型高效的检测器相继出现，其灵敏度高，兼具固定相、梯度洗脱技术以及高压输液泵，使得HPLC 得以快速发展。相比较于LC，HPLC 具有以下7 个特点：

第一，HPLC 综合运用了高效率固定相、细颗粒以及均匀填充技术，能够保证HPLC 具有极高的分离效率，柱效普遍已经达到104 个/m 理论塔板。 近年来，内径为0.05 μmm 的毛细管液相色谱柱和内径为1 mm 的微型填充柱相继出现，理论塔板数已经超过105 个/m，在分离的时候能够更高效地获得结果[4]。

第二，HPLC 在流动相输送的时候，采用了高压泵，并且还运用了梯度洗脱装置，可以在柱后运用检测器直接对洗脱组分进行检测。 HPLC 完成一次分离和分析普遍情况下只需要耗费几分钟到几十分钟，相对于 LC 来说耗时较少[5，6]。

第三，在检测过程中通过综合使用质谱、紫外、电化学以及荧光灯多种高灵敏度的仪器设备，能够保证HPLC 的最小检测量达到10.9～10.11 g。

第四，HPLC 中运用高度自动化计算机，不仅可以对数据信息实现自动化处理，自动化分析绘图和打印，还能够对色谱条件完成自动控制，确保色谱系统能够始终保持在最佳状态下，成为全自动化的仪器设备[7，8]。

第五，相较于气相色谱法（GC），HPLC 的使用范围更加广阔，在分离和分析沸点高、热稳定性水平差、相对分子质量大的有机化合物以及多种离子的时候，具有良好的效果。

第六，HPLC 具有广阔的流动相选择范围，并且流动相可以选择多种溶剂，通过改善流动相的组成情况，达到改善分离效果的目的，所以相较于GC，分离性质和结构类似的物质，具有良好的效果[9，10]。

第七，馏分容易收集更有利于制备。在测定饲料中的维生素B12时，使用HPLC 具有良好的效果。 本文通过试验，对应用HPLC 的流程和结果展开研究，以期为相关研究人员提供借鉴[11，12]。

2 仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪：P3000 泵，UV3000 检测器（北京市创新通恒科技有限公司）；色谱柱：依力特sinochrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5μm）。

试剂：维生素B12的对照品（中国药品生物制品检定所，批号为 100248-200201）；维生素 B12（市场上选购，批号为 20080801）；磷酸、甲醇（分析纯）；自制超纯水。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

试验中对色谱条件的限定要从填充剂、流动相、检测波长、流速、进样量和柱温6 个角度着手，限定条件详见表1。

表1 色谱元素限定条件表

3.2 制备对照品溶液

精密称取维生素B12对照品25 mg，放至250 mL容量瓶中，加入超纯水溶解，稀释至刻度线，摇匀，将其作为浓溶液。 吸取10 mL 维生素B12对照品溶液至100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀。

3.3 制备供试品溶液

精密称量试验样品，将其研磨为细粉。完成研磨之后，置于25 mL 容量瓶中，加入20 mL 超纯水，超声15 min，使其完全溶解，加水稀释至刻度线，摇匀。使用干燥滤纸对样品溶液进行过滤，使用0.8 μm 的微孔滤膜对滤液再次过滤，所得滤液备用。

3.4 开展系统适应性试验

分别吸取维生素B12对照品、纯水、供试品溶液20 μL，将3 种物质注入高效液相色谱仪中，详细记录色谱图结果。 通过对结果分析可知，维生素B12与干扰组二者之间存在良好的分离情况， 按照维生素B12将理论搭板数记作5 556。

3.5 考察线性关系

分别吸取维生素B12对照品浓溶液2.0、4.0、8.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mL，保证称量的精准度，将其放至100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度线，摇匀。各自从中吸取20 μL 进行测定，并且对峰面积做好记录， 归纳总结获得回归方程为Y=12710.1X-1977.4，线性相关系数r=0.999 9。 通过计算得知，维生素 B12浓度在 2.298～57.450 μg 时会表现出良好的线性关系。

3.6 精密度试验

连续6 次吸取维生素B12对照品溶液，按照峰面积计算相对标准偏差（RSD），所得结果为0.41%。

3.7 稳定性试验

吸取供试品溶液，分别将其放置0～5 h，按照规定的试验步骤完成对样品的测定工作，通过计算得知峰面积RSD 为0.96%，由结果可知，供试品溶液在5 h 之内性质稳定。

3.8 重复性试验

精密称取6 份相同批号的样品进行测定，获得的维生素 B12平均含量为 210.19 μg/g，峰面积 RSD 为1.35%。

3.9 加样回收率试验

精密称取6 份相同批号的样品，向其加入定量对照品溶液，按照规定的试验步骤完成样品的测量工作，并计算回收率，结果详见表2。

表2 维生素B12 含量回收率结果

3.10 样品测定

测定样品时要确保避光进行，按照规定步骤完成操作，吸取20 μL 供试品溶液和对照品溶液进行测定，将获得的色谱图做好记录，根据外标法计算峰面积，获得样品中维生素B12含量。

4 讨论

目前，测定饲料中维生素B12含量所用方法相对较多，其中较为常见的方法有酶联免疫法、微生物法、液相色谱-质谱串联法、高效液相色谱法（HPLC）等。酶联免疫法成本较高，且重复性较差，在国内检测维生素B12含量的研究中使用较少。 微生物法灵敏度较高，准确性很好，但是其检测周期相对较长，对实验人员操作水平的要求也很高，重复性较差，所以不能被广泛使用。 液相色谱-质谱串联法对设备的要求很高，并且实验所需的设备价格昂贵，普及较为困难。 在测定维生素B12含量时，只能检测含量较高的食品，若是食品中含有较为复杂的成分或维生素B12含量不高，便难以获得满意的检测结果。

HPLC 是一种新型的分离和分析技术，经典LC分析速度较慢，且其分离效率较低[2]。 随着科学技术的发展，新型高效的检测器相继出现，HPLC 也得以快速发展[3]。 相较于经典LC，HPLC 的使用范围更加广阔，在分离和分析沸点高、热稳定性水平差、相对分子质量大的有机化合物以及多种离子时，具有良好的效果[4，5]。

在测定饲料中的维生素B12时，使用HPLC 具有良好的效果。本文通过试验，对应用HPLC 的流程和结果展开研究，以期为相关研究人员提供参考。