UPLC－MS/MS 测定 4 种 β-受体激动剂残留量

杨晓忠 陈正菊 和丽毅

（丽江市疾病预防控制中心 云南丽江 674100）

1 前言

莱克多巴胺、克伦特罗、特布他林、沙丁胺醇均属于β－受体激动剂。 鉴于β－受体激动剂对人体的危害，我国规定养殖业中禁止使用此类药物[1，2]。 故GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》和农业部1629 号公告-1-2011 提出了液相色谱—串联质谱的方法测定多种β-受体激动剂[3，4]。本研究通过改良国家推荐的标准方法，简化试验步骤，缩短分析时间，在国家标准的基础上设计出符合本实验室试验仪器条件的测定方法，测量动物源性食品中4 种β-受体激动剂的残留量，并对结果进行分析。

2 材料和仪器

2.1 样品

从市场上采得云南省内12 个州、市的猪、牛、羊肉各8 件，共计动物肉样本量96 件。 云南省内9 个州、市的猪、牛、羊肝7 件，共计动物肝样本量63 件。

2.2 仪器与试剂

仪器：QTRAP 3500 质谱分析仪；岛津 LC-20A 高效液相色谱仪；电子天平；TG-3000 高速冷冻离心机；GM200 均质器；Fotector Plus 全自动固相萃取仪（含AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪）；Waters 固相萃取柱。

试剂：β-受体激动剂标准品：莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、克伦特罗（纯度均大于98.0%）；内标物：D9-克伦特罗、D6-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇（纯度均大于99.0%）；乙酸钠-醋酸缓冲液；β-葡萄糖苷酸酶-芳基硫酸酯酶；盐酸；去离子水；甲醇；乙酸乙酯；乙腈。

2.3 试验方法

2.3.1 标准曲线的制作

制成β-受体激动剂含量分别为 2.0、4.0、6.0、10.0、20.0 ng/mL 的标准系列溶液（含10 ng/mL 的内标溶液）供样品测定用，内标法制作标准曲线。

2.3.2 样品前处理

酶解：将样品绞碎后，称取5 g 样品于50 mL 的离心管中；加入40 μLβ-受体激动剂内标混和应用液（250 μg/L）静置 10 min 后加入 15 mL 乙酸钠-醋酸缓冲液（pH=5.2，0.2 moL/L），均质 20 s，再加 100 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶液，在37℃避光水浴中振荡水解过夜（将近16 h）后取出放至室温。

提取：酶解放置室温后涡旋混匀，以12 000 r/min转速离心10 min，吸取上层溶液，置于另一50 mL 的离心管内；用盐酸（3.0 moL/L）调节 pH=2.0±0.1，以12 000 r/min 转速离心10 min，分出上清液备用。

净化：依次用水、甲醇、盐酸溶液（40 mmoL/L）各5 mL 活化平衡固相萃取柱，样品过固相萃取柱后，用水、甲醇各5 mL 淋洗除杂，真空抽干柱内液体，加入10 mL 5%氨化乙酸乙酯进行洗脱，再将其收集于10 mL 具塞试管内用全自动浓缩仪浓缩。 残留物中加入0.1 mL 甲醇溶液，超声溶解，再加入0.9 mL 10%甲醇水溶液混匀，经滤膜过滤后，待高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）检测。

2.3.3 测定条件

色谱条件：色谱柱：Thermo Hypersil ODS（C18）热电液相色谱柱（2.6 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温：40℃；流动相：0.1%甲酸水（A）+0.1%甲酸乙腈溶液（B）；进样量：5 μL，梯度洗脱见表1。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：550℃；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；碰撞电压和锥孔电压根据仪器调至最优灵敏度。

表1 梯度洗脱表

2.4 线性范围和检出限

标准系列溶液测定结果表明，4 种β-受体激动剂在浓度为2～20 ng/mL 时，线性关系较好，线性相关系数（r）均大于0.998。 采用在空白样品中添加目标化合物的方法，3 倍信噪比确定4 种β-受体激动剂检出限为 0.11～0.14 μg/kg。 10 倍信噪比确定定量限为 0.33～0.41 μg/kg。 4 种 β-受体激动剂标准溶液的参考选择性离子色谱图详见图1。

2.5 加标回收率和精密度

取不含β-受体激动剂类药物的2 种样品进行加标回收率试验和精密度试验，加标水平浓度分别为2.0 ng/mL 和3.0 ng/mL，每个加标水平进行3 次平行试验，其加标回收率为85.65%～111.27%，相对标准偏差（RSD）均小于20%。

2.6 样品的测定

按照以上建立的方法进行检测，并与标准样品对照，根据第一个子离子的峰面积定量，根据第二个子离子的峰保留时间定性，结果显示159 份样品均为阴性。

3 讨论

3.1 样品前处理的优化

与国家标准中所用的阳离子交换小柱相比，本方法采用Waters 固相萃取柱净化，结果显示，具有弱碱性的β-受体激动剂在酸性条件下对Waters 小柱有很强的吸附作用。 且有研究发现[5]，用5%氨化乙酸乙酯洗脱，洗脱液较为干净，杂质少，易吹干，有很好的净化效果，故选用5%氨化乙酸乙酯进行洗脱。

3.2 色谱条件的选择

3.2.1 梯度洗脱系统的选择

国家标准中所用的洗脱时间为25.5 min，本试验优化了梯度洗脱比例成分，缩短了洗脱时间。本研究发现，选择上述的梯度洗脱时间更为合适，既可以在更短的时间内使峰完全分离，也不会产生太大干扰，重现性和峰形都较好，达到了和国家标准所用洗脱方法同样的效果而且更适用于本实验室的试验仪器条件。

3.2.2 色谱柱柱温的选择

国家标准中色谱柱的柱温是30℃，但是根据本试验所用的色谱柱固定液的使用温度、色谱柱类型、样品组分的复杂程度及色谱柱升温方式等，本试验采用的色谱柱柱温为40℃，在这个温度下既保证了样品组分完全分离，又保证了样品所有组分都不会在色谱柱内冷凝，且峰形较好。

图1 4 种受体激动剂选择性离子流图

4 结论

本文对云南12 个州、市的牛、羊、猪肉及肝进行检测，莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林均未检出。 可能的原因是所建立的方法检出限不够低或者是由于国家的打击力度够大，没有不良商家售卖含瘦肉精的牛、羊、猪肉及肝。

通过改良国家标准推荐方法中的分析条件，本文建立了UPLC－MS/MS 测定动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林的残留量的方法。该方法样品无需衍生化，且能够很好地对分析物进行定性确认，分离效率高，灵敏度高，基体干扰少，检出限低，操作可行，重复性好，能够满足当前市场对相关残留检测的要求。