基于UPLC含量测定的不同厂家穿心莲胶囊质量评价

赵振霞，苏建，孔亚萍，刘永利

河北省药品检验研究院，石家庄 050011

穿心莲胶囊是由穿心莲单味药制成的中成药，具有清热解毒、凉血消肿的功效，是临床常用清热解毒用药，主要用于咽喉肿痛、口舌生疮等[1]。穿心莲主要有效成分为穿心莲内酯(andrographolide，AP)、脱水穿心莲内酯(dehyandrographolide，DAP)、去氧穿心莲内酯和新穿心莲内酯等二萜内酯类成分，其中AP和DAP含量较高，在解热消炎、抗肿瘤等方面具有较强的药理作用[2-4]。全国穿心莲胶囊的生产企业共有28家，此次依托国家药品评价抽验，在全国药品生产、经营、使用单位共抽取了27批样品，涉及4个生产企业，基本覆盖了目前市场上主流产品。本研究采用超高效液相色谱法(UPLC)，建立了同时测定穿心莲胶囊中AP与DAP含量的方法，对27批穿心莲胶囊样品的含量进行分析，发现了穿心莲胶囊的主要质量问题，为药品生产企业改进质量与完善质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(配备四元泵、DAD 检测器，美国 Waters 公司)；AE240型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司)；KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水仪(美国Millipore 公司)。

1.2 试药

AP对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110797-201609，纯度：99.7%)；DAP对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110854-201509，纯度：99.4%)；穿心莲胶囊样品抽自全国药品生产、经营、使用单位；甲醇、乙腈(色谱纯，Merck，Germany)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱选用ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～5 min，10%～15%A；5～15 min，15%～22%A；15～20 min，22%～25%A；20～30 min，25%～35%A)；柱温：30 ℃，流速：0.3 mL·min-1；检测波长：225 nm(AP)、254 nm(DAP)。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 分别精密称取AP对照品、DAP对照品10.45、10.90 mg，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.208 4、0.216 7 mg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约1粒的量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备 取穿心莲胶囊阴性样品粉末适量(按处方及工艺，制备不含穿心莲的阴性样品)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性实验

精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，AP和DAP与相邻成分均可达到较好的分离，分离度>1.5，理论板数以AP峰计不低于5000，且阴性无干扰，说明系统适用性良好，见图1。

注：1.AP；2.DAP。图1 穿心莲胶囊专属性UPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系考察 依次精密量取不同浓度的AP对照品溶液与DAP对照品溶液2 μL，分别注入超高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。结果表明，AP在0.082 6～2.064 8 μg呈良好的线性关系，回归方程：Y=7.863×106X+6.103×104(r=0.999 9)；DAP在0.040 8～1.019 7 μg呈良好的线性关系，回归方程：Y=6.239×106X+5.327×104(r=0.999 9)。

2.4.2稳定性试验 取按2.2项下制备的同一份穿心莲胶囊供试品溶液，照2.1项下的色谱条件分别在0、1、2、4、8、16、24 h进样测定，记录峰面积，AP和DAP峰面积的RSD分别为0.85%、1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验 取同一批穿心莲胶囊样品，研细，取0.15、0.30、0.45 g，各3份，精密称定，分别按2.2项下制备方法制备供试品溶液，照2.1项下的色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，计算得到AP和DAP的平均质量分数分别为46.64、17.99 mg·g-1，RSD分别为1.1%、1.6%，表明该方法重复性良好。

2.4.4加样回收率试验 精密称取已知含量的穿心莲胶囊样品约0.15 g，共9份，分别加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，按2.2项下制备方法制备供试品溶液，照2.1项下的色谱条件进样测定，计算回收率及其RSD，结果见表1，表明该方法回收率较好。

表1 穿心莲胶囊中AP与DAP加样回收率试验结果(n=9)

2.5 样品测定

精密吸取按2.2项下方法制备的穿心莲胶囊供试品溶液，照2.1项下的色谱条件依次进样测定，按外标法计算各样品中AP和DAP的含量，结果见表2，不同生产企业之间测定结果比较的箱式图见图2。

表2 穿心莲胶囊中AP与DAP的含量测定结果 mg/粒

含量测定结果显示，27批穿心莲胶囊样品中，AP与DAP的含量分别为0.94～7.50、5.62～10.12 mg/粒。箱式图显示，不同生产企业之间DAP的含量相差较小，测定结果较为集中；而AP的含量相差悬殊，部分样品的测定结果较低；表明生产企业在生产中未关注AP含量，只关注了法定标准中测定的DAP含量。另外，各企业样品都是DAP含量>AP含量，与药材中两者含量相反[5-7]，可能与药材质量、生产工艺等有关。

AP聚类分析(见图3)显示，广西千珍制药有限公司的样品单独聚为一类，说明与其他企业之间存在明显差异，从测定结果也可以看出广西千珍制药有限公司的样品含量测定值比其他企业要高；DAP聚类分析结果显示，各企业不同批次之间样品含量测定结果都有交叉，说明企业之间的差异性较小。

图2 穿心莲胶囊中AP与DAP的含量测定结果

注：A.AP;B.DAP；使用平均联接(组间)的树状图重新调整距离聚类合并。图3 穿心莲胶囊含量测定聚类分析结果

3 讨论

3.1 提取条件的选择

在前期实验中考察了回流提取法和超声提取法对样品中AP和DAP提取量的影响。结果表明，回流和超声对两者的提取量差异无统计学意义，且超声提取法简单、方便，故确定超声提取法为样品提取方法。还对40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和甲醇等不同提取溶剂进行考察，结果表明，采用甲醇为溶剂提取效果最好。

3.2 检测波长的选择

采用紫外全波长光谱扫描得到AP最大吸收波长在225 nm处，DAP最大吸收波长在254 nm处，选用其中任意一个波长，另一组分响应值都较低，因此选定双波长法对样品进行测定。

3.3 样品质量评价

中成药是通过整体作用而发挥疗效，因此生产中需尽可能关注所有成分的变化情况，而不是仅仅关注质量标准中测定的指标成分。此次样品测定结果表明，企业只关注了法定标准中规定的DAP含量，未关注AP含量，而AP稳定性较差，在提取过程中易降解[8]，文献报道通过合适的工艺参数可有效提高AP的转移率[9-10]，因此企业需优化工艺参数，保证AP与DAP的转移率。

3.4 意义

鉴于中药的特殊性，采用何种方法对其质量进行评价，是目前行业内亟须解决的关键问题[11-12]。虽然多成分的含量测定技术并不足以对产品不同批次质量的一致性进行科学全面的评价，但在实际生产过程中，厂家可以通过对这2种主要成分含量变化的关注，快速、科学地评价产品质量。另外，本研究对穿心莲胶囊的质量标准的提高也具有重要意义。