祖师麻片对CCI模型大鼠脊髓背角P2X4受体及p38 MAPK表达的影响△

宋敬怡，张天睿，马丹，程龙，程文豪，李颖慧，张硕峰*，格桑顿珠

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.西藏藏医药大学 藏药系，西藏 拉萨 850000

祖师麻为瑞香科植物黄瑞香DaphnegiraldiiNitsche、陕西瑞香DaphnetanguticeMaxim.或凹叶瑞香DaphneretusaHemsl.的干燥茎皮及根皮。其味辛、苦，性温；有小毒；归肝经，具有祛风除湿、止痛散瘀的功效，其制剂祖师麻片收载于《中华人民共和国药典》2015年版，临床用于治疗坐骨神经痛及风湿、类风湿性关节炎。

坐骨神经痛属于神经病理性疼痛的一种。神经病理性疼痛的产生可导致神经系统对痛觉信号的产生、处理、传递等发生功能性障碍[1-2]。本研究采用慢性挤压神经损伤(chronic constriction injury of the sciatic nerve model，CCI)诱导的坐骨神经损伤大鼠模型[3-4]，以痛反应时间(thermal withdrawal threshold，TWT)、50%机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，50% MWT)为指标，观察祖师麻片对CCI模型大鼠神经病理性疼痛的抑制作用，并检测CCI模型大鼠患侧脊髓背角中丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)以及P2X4受体表达，以分析祖师麻片抑制坐骨神经痛的可能机制，为其在临床的应用提供试验依据。

1 材料

1.1 实验动物

6～7周龄SPF级SD大鼠84只(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号分别为11400700192661、11400700193358、11400700202282)，雌雄各42只，体质量(200±20)g。大鼠饲养于北京中医药大学动物房，许可证号：SYXK(京)2016-0038，实验过程中严格按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。并获得北京中医药大学实验动物福利伦理委员会的批准(批准号：BUCM-4-2017090109-3009)。实验前，大鼠适应性饲养3 d。

1.2 试剂

祖师麻片剂(秦皇岛市山海关药业有限责任公司，批号:20140702)，颜色为红棕色，规格0.3 g/片，临床人用量为每日3次，3片/次，即2.7 g·d-1，按照人体质量为75 kg进行计算，即36 mg·kg-1。确定大鼠受试剂量为0.432、0.216、0.108 g·kg-1，即常规用量的12、6、3倍量。布洛芬缓释胶囊(天津中美史克制药有限公司，批号:16080652)，规格4 mg/粒，常规用药量为8 mg·kg-1·d-1，本实验采用48 mg·kg-1作为阳性药组大鼠的受试剂量，即常规用药量的6倍。

兔抗P2X4多克隆抗体、兔抗p38 MAPK抗体(Proteitech公司)；DAB显色剂、兔二抗超敏试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 仪器

Von-Frey纤维毛(美国Stoelting公司)；冷/热盘测痛仪(美国IITC公司)。

2 方法

2.1 分组及给药

SD大鼠84只，雌雄兼用。结扎手术完成后第8天按TWT值运用对位随机法分为7组，分别为对照组、模型组、假手术组、布洛芬组及祖师麻片0.432、0.216、0.108 g·kg-1组。

布洛芬组及祖师麻片各剂量组大鼠于术后1周(即第8天)开始灌胃给药，每天给药1次，共14次，对照组、模型组、假手术组大鼠给予相同质量的0.9%氯化钠溶液。在造模后20 d测定相关行为学数据。

2.2 CCI模型的制备

除对照组外，其余各组大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉，呈俯卧状趴于手术台上，右后肢外侧褪毛处理。褪毛完成后将外侧皮肤消毒后剪开，依次拨开皮肤、脂肪、浅筋膜直至看到股二头肌，用眼科镊将股二头肌分离，用镊子轻柔地将坐骨神经主干挑起，以相邻结扎线的距离约为1 mm长度对坐骨神经进行结扎，共结扎4道。如大鼠大腿肌肉出现微微颤动，则说明结扎力度适宜[5]。结扎完毕之后将肌肉和皮肤逐层缝合，缝合处涂抹碘酒防止伤口感染。

2.3 指标检测

2.3.1TWT测定 测定时间均设定在8：00～16：00。将大鼠放入透明玻璃罩内适应5 min，测量的开始时间为大鼠停止探觅行为。开启冷/热盘测痛仪，温度调至55 ℃，测定时间上限30 s，观察部位为患肢(即右后足)。当仪器加热到指定温度后，大鼠会因灼热出现不停抬足或舔足现象，此时为时间记录终点。记录的时间长度应为自开启仪器至大鼠右后足出现舔足反应所用的时间，每只大鼠测量3次，每次测量距离上次测量的时间超过10 min，痛反应时间为3次测量数据的平均值。

2.3.250% MWT的测定 测定时间均设定在8：00～16：00，室温20～25 ℃，湿度46%～52%。将大鼠置于提前准备好的笼内，测量开始之前应使大鼠充分适应周围环境，待其安静后开始测量。利用Von-Frey纤维毛对其患肢(即右后足)进行刺激，方法为上下法，观察大鼠患肢对Von-Frey纤维毛刺激出现的反应。选用的Von-Frey纤维毛质量分别为15、26、60、100、180、300 g，测量开始先用最小克数纤维毛对大鼠的患肢进行刺激，若大鼠对纤维毛产生蹬踹或缩足的变化记作O(阳性反应)，反之记作×(阴性反应)。当反应为O时，选取比当前用于测量的纤维毛质量低1级的纤维毛进行刺激，当反应为×时，选用比当前用于测量的纤维毛质量高1级的纤维毛刺激。当连续2个及2个以上性质相同的反应后出现与当前性质相反的反应时，此反应所对应的数值即为第1个正式数据，之后再测5个数据，则每只大鼠的正式数据共6个。查纤维毛换算系数表[6]并按照公式(1)计算50%引起阳性反应量(ED50)。

ED50=10loga+k×b

(1)

a：用于正式数据所对应的纤毛质量；b：相邻纤毛的对数差的平均值；k：表中的相应参数。

2.3.3免疫组织化学反应显色 末次给药后1 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注，取出大鼠脊髓段L4～6后立即放入4%多聚甲醛溶液固定。脊髓段固定好后，经脱水、包埋处理后，每组随机抽取较完整的6只大鼠脊髓组织进行切片，每张厚度为3 μm左右。切片脱蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3 min×3；3%H2O2(15 min)封闭内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min×3；微波炉加热20 min进行抗原修复；PBS洗3 min×3；加一抗在37 ℃温箱孵育1 h，4 ℃过夜；次日取出，PBS洗3 min×3；加二抗孵育2 h，DAB显色，放入水中充分洗涤；树胶封片，观察结果。

本实验每只大鼠选取3张切片，于显微镜200倍的视野中观察免疫组化法染色后脊髓中P2X4和 p38 MAPK的表达情况，光镜下阳性表达区呈现棕褐色，每张切片随机选取3个视野，完成后计算出各组别脊髓背角区域中阳性显色的平均吸光度(A)。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 祖师麻片对CCI大鼠痛阈值的影响

结果显示，大鼠结扎坐骨神经21 d后，患侧痛阈值明显降低，表现为TWT缩短，50% MWT降低(P<0.01)，提示模型大鼠患肢对温度刺激、机械刺激敏感度提高，表现为痛觉过敏。与模型组比较，祖师麻片各剂量给药后14 d，可明显抑制大鼠患肢对温度刺激、机械刺激敏感度的减低，表现为明显延长TWT，提高50% MWT值(P<0.05，P<0.01)，结果见表1。

表1 祖师麻片对CCI大鼠痛阈值的影响

3.2 祖师麻片对CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受体表达的影响

造模21 d后，模型大鼠患侧脊髓背角p38 MAPK、P2X4受体的表达水平明显提高(与假手术组、对照组比较，P<0.01)。与模型组比较，祖师麻各剂量可不同程度抑制大鼠患侧脊髓背角中p38 MAPK、P2X4受体表达水平的增高(P<0.01)，见表2和图1～2。

表2 祖师麻片对CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受体表达的影响

注：A.对照组；B.假手术组；C.模型组；D.布洛芬组；E.祖师麻片0.108 g·kg-1组；F.祖师麻片0.216 g·kg-1组；G.祖师麻片0.432 g·kg-1组；下同。图1 祖师麻片对CCI大鼠患侧脊髓背角p38 MAPK表达的影响

图2 祖师麻片对CCI大鼠患侧脊髓背角中P2X4表达的影响

4 讨论

神经病理性疼痛是神经系统受到机械损伤或炎症侵害等引发的一种慢性疼痛，常导致痛觉的敏化，即痛觉过敏或触痛超敏。CCI模型是临床研究神经病理性疼痛常用的动物模型之一。本研究表明，在大鼠结扎坐骨神经1周后，其患肢对热刺激、机械刺激敏感程度上升，具体表现为TWT缩短，50% MWT降低并随着时间的推移有加重趋势。提示结扎大鼠坐骨神经可导致其产生痛觉过敏，与坐骨神经痛的临床症状一致。祖师麻为瑞香科植物，具有较强的抗炎、镇痛作用[7-8]，其制剂广泛用于类风湿、坐骨神经痛、跌打损伤等疾病的治疗[9-10]，但深入研究较少。本研究结果表明，祖师麻片可明显延长CCI模型大鼠患肢的TWT、提高50% MWT，显现出较强的抑制痛觉敏感的作用，与文献报道一致。

痛觉敏感是病理性疼痛的主要症状，而中枢敏化是产生痛觉敏感的主要机制。脊髓神经元的可塑性使神经细胞的兴奋性升高及痛觉的传导性提高，是痛觉中枢敏化的主要机制。MAPK在受体间的信号传导过程中有着至关重要的作用，p38 MAPK作为MAPK家族中重要的信号通路之一，近年来受到了广泛关注[11-12]。p38 MAPK广泛存在于神经细胞和小胶质细胞中，可完成通路信息间的交流，可参与神经病理性疼痛的形成与维持。腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate)是全身重要的供能物质，可以作为信号分子作用于小胶质细胞表面[13]。神经损伤产生后，小胶质细胞表面的P2X4受体上调[14]，使神经细胞p38 MAPK激活并表达增强，p38 MAPK激活后可提高神经元的兴奋性，机体表现为疼痛感增强[15]。

本研究表明，CCI大鼠进行坐骨神经结扎后，脊髓背角的P2X4受体和p38 MAPK表达显著性增多，与TWT、50% MWT的结果一致。布洛芬可抑制脊髓背角小胶质细胞表面的P2X4受体激活，患侧脊髓背角p38 MAPK表达下调，阻断中枢敏化的形成[6]，与实验结果一致。祖师麻片可明显抑制p38 MAPK和P2X4受体在CCI大鼠患侧脊髓背角的表达，与给药后模型大鼠的痛阈提高变化一致。提示祖师麻片可有效抑制CCI模型大鼠脊髓背角的P2X4受体上调，进而导致p38 MAPK的表达下降，使脊髓背角神经细胞的兴奋性降低，调节痛觉信号传导，疼痛反应减轻，这可能是祖师麻在脊髓水平发挥镇痛作用的机制之一。

综上所述，祖师麻片可抑制结扎大鼠坐骨神经所致的痛觉敏感，其机制与抑制脊髓患侧背角中P2X4受体表达以及抑制p38 MAPK通路有关。