单面针HPLC指纹图谱及质量标准研究

2020-11-16刘倩倩雷思敏胡玉珍夏伯候林艳林丽美龚云张鹏吴萍

中国中医药信息杂志 2020年10期

刘倩倩，雷思敏，胡玉珍，夏伯候，林艳，林丽美，龚云，张鹏，吴萍

单面针HPLC指纹图谱及质量标准研究

刘倩倩1，2，雷思敏1，2，胡玉珍1，2，夏伯候1，2，林艳1，2，林丽美1，2，龚云3，张鹏3，吴萍1，2

1.湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208；2.湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室，湖南长沙 410208；3.株洲千金药业股份有限公司，湖南株洲 412003

建立单面针药材的特征指纹图谱，测定单面针中木兰花碱、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量，以控制单面针药材质量，并为与两面针的区别提供参考。采用HPLC建立基于区分两面针的单面针指纹图谱，色谱柱为Athena C18，120A（4.6 mm×250 mm，5 µm），以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长283 nm。采用主成分分析及正交偏最小二乘-判别分析对单面针和两面针指纹图谱进行比较，筛选其差异标志物，并利用对照品进行标志物鉴定和含量测定。参照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则方法测定单面针的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量。建立了单面针特征指纹图谱，发现了区分单面针与两面针的11个标志性化合物，指认出其中1个标志物为木兰花碱。木兰花碱在0.48～5.76 μg范围内呈良好线性关系（＝1），平均加样回收率为97.23%，RSD＝1.31%，样品含量为2.227 3～21.027 2 mg/g。单面针中水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量分别为5.016%～10.910%、2.487%～5.973%、0.027%～0.147%、0.548%～2.512%、0.332%～2.113%。本研究建立的方法操作简便，准确性及重复性好，可用于评价单面针药材的质量。

单面针；高效液相色谱法；质量标准；木兰花碱

单面针为芸香科植物蚬壳花椒Hemsley或刺壳花椒Hemsley的干燥根和茎[1]，两面针为芸香科植物两面针（Roxb.）DC.的干燥根[2]169，二者生长于我国广东、广西、湖南、云南等山地林中，具有活血散瘀、祛风活络、续筋接骨功效，用于治疗跌打损伤、骨折等[3-4]。单面针与两面针的化学成分及活性比较相似，但缺乏完善的质量控制标准，与两面针混淆使用现象严重，因此，二者的比较研究具有现实意义。杨鹏等[5]利用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术鉴定出单面针和两面针中32种生物碱，发现两者所含生物碱种类相似，且单面针中生物碱苷种类更丰富、含量也较高。陈铁寓等[6]通过二阶导数光谱结合二维傅里叶红外光谱方法可将两者完全区分开来。

目前，两面针已被《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收录，单面针仅在2015年版《中国药典》妇科千金片项下出现[2]902。2009版《湖南中药材标准》收载单面针，但缺乏专属性和可定量的指标，无含量测定项[1]。研究表明，单面针具有抗菌、抗乳腺癌等活性[7]。有学者采用HPLC测定单面针中生物碱含量，发现单面针中含量最高的成分为木兰花碱[8-9]。本试验在前期研究基础上，采用HPLC结合化学计量学方法分析单面针与两面针指纹图谱，筛选二者的差异性化学成分，对木兰花碱含量进行测定，同时测定单面针中水分、灰分、浸出物含量，建立单面针药材的质量控制标准，以期为单面针药效物质基础研究和质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司）；SQP型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；P20-Y实验室超纯水机（湖南科尔顿水务有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SZ-500A-3超高速多功能粉碎机（永康市善竹贸易有限公司）；SCAA-104（13 mm，0.22 μm）有机相针式滤器（上海安谱实验科技股份有限公司）。

木兰花碱对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号M-026-170612，纯度≥98%）。甲醇（德国Merck公司，色谱纯），甲酸（天津市化学试剂研究所，分析纯），水为超纯水。单面针药材分别购于广西、广东、湖南、湖北等地，两面针药材购于全国各大连锁药店、医药公司及药材市场，经湖南中医药大学药学院药用植物教研室刘塔斯教授与中药鉴定教研室龚力民副教授共同鉴定，分别为芸香科花椒属科植物蚬壳花椒Hemsley及两面针（Roxb.）DC.的茎，样品来源信息见表1、表2。

表1 单面针药材样品来源信息

编号产地收集日期 S1陕西省汉中市南郊区2016-03-06 S2陕西省榆林市青云镇2016-03-08 S3陕西省安康市汉滨区2016-05-01 S4湖北省襄阳市保康县2016-07-02 S5湖北省襄阳市樊城区2016-07-02 S6湖北省襄阳市南漳县2016-07-02 S7四川省眉山市青神县2017-01-01 S8四川省资阳市资中县2017-02-03 S9广西壮族自治区来宾市象州县2017-04-02 S10广西壮族自治区玉林市玉州区2016-11-17 S11广东省陆丰市碣石镇2016-11-17 S12广东省广州市海珠区2017-01-01 S13广东省广州市番禺区2016-08-17 S14广东省广州市天河区2016-08-17 S15湖南省吉首市双塘镇2016-08-19 S16湖南省吉首市丹青镇2016-08-19 S17湖南省湘西土家族苗族自治州永顺县2016-05-01 S18湖南省张家界市永定区2016-05-01 S19广东省广州市南沙区2017-01-01 S20广西壮族自治区南宁市江南区2016-11-17 S21湖南省吉首市河溪镇2016-08-01 S22湖南省湘西土家族苗族自治州永顺县2016-08-01 S23广西壮族自治区桂林市资源县2016-11-17 S24湖南省湘西土家族苗族自治州花垣县2017-06-01 S25湖南省湘西土家族苗族自治州泸溪县2017-06-01

表2 两面针药材样品来源信息

编号来源产地收集日期 S26广西玉林中药材市场广西玉林2016-02-01 S27湖南湘潭中药材批发市场湖南湘潭2016-05-01 S28湖南千金药材有限公司湖南株洲2016-05-01 S29湖南岳阳市养天和大药房湖南岳阳2016-05-01 S30广西贺州市大参林药房广西贺州2016-08-01 S31广西药材有限公司广西南宁2016-08-01 S32湖南楚铭堂中药有限公司湖南常德2016-05-01 S33广东佛山臻诚中药有限公司广东佛山2016-11-01 S34广东汕头吉庆善养生堂药店广东汕头2016-11-01 S35广东广州大参林药房广东广州2016-11-01 S36广东清远老百姓大药房广东清远2016-11-01 S37广东珠海海王星辰连锁药店广东珠海2016-11-01 S38湖南长沙千金大药房湖南长沙2016-05-01 S39湖北心连心连锁大药房湖北荆州2016-07-01 S40安徽亳州药材市场安徽亳州2016-08-01

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液

分别取25批单面针样品和15批两面针样品，置真空干燥箱中，45 ℃干燥至恒重，粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇5 mL，密塞，称定质量，浸泡12 h，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）45 min，放冷，称定质量，以70%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液

精密称取干燥至恒重的木兰花碱对照品适量，置25 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解，定容，制得浓度为1.6 mg/mL的木兰花碱对照品溶液，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得木兰花碱贮备液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Athena C18，120A（4.6 mm×250 mm，5 µm），以甲醇-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱（见表3），流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长283 nm，进样量10 µL。

表3 流动相梯度洗脱程序（%）

时间甲醇0.1%甲酸水 0 min694 12 min4060 14 min4060 25 min6535 30 min1000 35 min1000

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一批单面针样品（S17），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，检测指纹图谱，木兰花碱相对峰面积RSD＝1.22%，相对保留时间RSD＝0.47%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批单面针样品（S17）6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，木兰花碱峰面积RSD＝0.63%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一批单面针样品（S17），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h按“2.2”项下色谱条件测定，木兰花碱峰面积RSD＝1.03%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4 线性关系考察

分别精密移取木兰花碱贮备液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，加甲醇稀释定容至10、10、10、5、5、5 mL，得到浓度分别为0.048、0.096、0.144、0.384、0.480、0.576 mg/mL的系列对照品溶液，分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程＝7.36×106＋4.38×104，＝1，木兰花碱在0.48～5.76 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的单面针样品（S17）粉末0.5 g，共6份，分别精密加入0.48 mg/mL木兰花碱对照品溶液0.5 mL，冻干样品，再按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，过滤，按“2.2”项下色谱条件测定，计算平均回收率及RSD，结果木兰花碱的平均加样回收率为97.23%，RSD＝1.31%，见表4。

表4 木兰花碱加样回收率试验

取样量 /g样品中含量 /mg加入量 /mg测得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.501 51.362 90.240 01.600 098.7997.231.31 0.501 01.362 30.240 01.591 195.33 0.500 71.361 80.240 01.597 398.13 0.501 31.362 60.240 01.596 997.63 0.500 61.361 80.240 01.592 696.17 0.500 91.362 00.240 01.595 697.33

2.4 指纹图谱建立

取25批单面针样品和15批两面针样品，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析。将色谱图导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版），选定参照图谱，时间漂移值为0.5，采用多点校正、平均数法对色谱峰自动匹配，分别得到25批单面针样品（S1～S25）及15批两面针样品（S26～S40）的HPLC叠加图谱，见图1、图2。同时生成单面针及两面针对照图谱，将二者对照图谱进行比较，标示出共有峰及各自的特征峰，经对照品图谱比对，指认其中保留时间12.3 min左右的3号峰为木兰花碱，见图3。可以看出，单面针和两面针存在16个共有峰，且两者具有各自的特征峰，单面针特有峰为a～d，两面针特有峰为e～g。

图1 25批单面针（S1～S25）HPLC叠加图谱及其对照指纹图谱

图2 15批两面针（S26～S40）HPLC叠加图谱及其对照指纹图谱

注：A.单面针；B.两面针；C.木兰花碱对照品

2.5 主成分分析

40批样品指纹图谱16个共有峰的原始数据不能体现出样品之间的差异，故利用投影方法对原始数据进行标准化后，进行无监督的主成分分析（PCA）[14]。将原始数据导入SIMCA13.0软件，分析结果见图4。可见40批样品有明显区分趋势，两面针样品居左侧且较分散，单面针居右侧并分为上下两群，其中单面针中S25（湖南湘西泸溪县）与其他样品差异较大，两面针中S30（广西贺州）与其他样品差异较大。

图4 40批样品PCA得分图

2.6 正交最小偏二乘-判别分析

正交最小偏二乘-判别分析（OPLS-DA）可以提高模型的有效性和解析能力，采用有监督情况下模式识别分析方法倾向于提取有利于样本分类的变量信息，降低系统噪音的干扰，提高分类的效能[12]。将40批样品指纹图谱原始数据导入SIMCA13.0软件，得到OPLS-DA得分图（见图5）。可以看出，单面针和两面针明显分为两类，左侧为单面针（S1～S25），右侧为两面针（S26～S40），且单面针样品较集中，而两面针样品间差异较大。

图5 40批样品OPLS-DA得分图

2.7 差异标记物筛选与鉴定

提取OPLS-DA模型中16个共有峰的变量重要性投影（VIP），结果见图6。对16个共有峰峰面积VIP值从大到小进行排序，分析对单面针及两面针分类具有显著影响的成分。根据VIP＞1.0、＜0.05进行筛选，符合要求的有11个峰，表明其所代表的成分是引起单面针与两面针差异的主要标志性成分。经与对照品比对，其中3号峰为木兰花碱，其他化合物为未知物。因此，可以将木兰花碱作为单面针区别于两面针的指标性成分。

图6 单面针和两面针差异标志物VIP图

2.8 样品含量测定

精密取40批样品粉末，按“2.1.1”项下方法制备，取供试品溶液及对照品溶液各2 μL，分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，记录木兰花碱峰面积积分值，代入回归方程，计算样品中木兰花碱含量。每份样品平行测定3次，结果见表5。采用SPSS21.0软件对单面针和两面针中木兰花碱含量数据进行独立样本检验，结果表明差异有统计学意义（＜0.01）。结合差异标记物筛选及鉴定结果，木兰花碱包含在差异性标志物中且差异较大，因此，可以将该成分作为区分单面针与两面针的重要指标性成分。

表5 样品中木兰花碱含量测定结果（mg/g，n＝3）

编号木兰花碱编号木兰花碱编号木兰花碱 S13.892 5 S152.451 1 S2915.844 8 S22.529 1 S162.529 1 S3021.027 2 S33.027 1 S172.723 0 S3110.855 6 S42.459 5 S184.038 7 S3211.603 2 S53.227 8 S192.768 6 S3319.905 8 S63.319 1 S202.824 0 S3417.990 1 S72.365 5 S212.295 0 S3516.820 9 S82.880 9 S222.476 5 S3610.455 2 S92.606 9 S232.453 1 S3718.948 3 S103.375 8 S242.345 9 S3816.822 6 S112.256 3 S252.885 9 S3918.208 8 S122.227 3 S2613.439 1 S4015.332 2 S133.485 8 S2716.858 9 S142.630 5 S2817.075 2

2.9 单面针样品检查项测定

取25批单面针样品，粉碎，过2号筛，精密称取2.0 g，按2015年版《中国药典》（四部）通则0832测定水分。精密称取单面针样品粉末约4.0 g，按2015年版《中国药典》（四部）通则2302测定总灰分和酸不溶性灰分。精密称取单面针样品粉末约4.0 g，分别以水和70%乙醇为浸出液，按2015年版《中国药典》（四部）通则2201测定水浸出物和醇浸出物含量。每批平行测定3次，取平均值，结果见表6。25批单面针药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物的含量范围分别为5.016%～10.910%、2.487%～5.973%、0.027%～0.147%、0.548%～2.512%、0.332%～2.113%，平均值分别为7.212%、4.230%、0.063%、1.716%、1.483%。因此，单面针中水分及总灰分含量规定可沿用原有地方标准，建议酸不溶性灰分含量不超过0.15%，浸出物含量不低于0.5%。

表6 单面针样品检查项测定结果（%，n＝3）

编号水分总灰分酸不溶性灰分水浸出物醇浸出物 S17.0464.3220.0961.9591.282 S25.7193.6710.0551.4011.255 S35.5894.1630.0401.1201.709 S46.5603.5080.0541.7271.709 S55.9604.0070.0781.5471.705 S65.7943.8700.0272.0061.474 S77.1704.6850.0542.0131.319 S85.0763.0880.0571.6711.267 S95.0163.0390.0531.4711.435 S105.9303.6320.0461.6811.368 S116.4244.7350.0712.1641.594 S126.0344.5610.1312.1101.873 S136.8564.9900.1471.9272.056 S146.5524.2210.0981.5482.033 S156.7845.9730.0282.2381.872 S166.5843.8900.0352.4361.701 S176.4814.7030.0772.1481.695 S187.1335.4840.0721.9771.650 S196.1865.3140.0382.5121.756 S209.6353.6310.0301.9321.235 S2110.2304.7030.0450.5480.332 S2210.3104.3220.0771.1510.364 S2310.9102.4870.0571.9592.113 S2410.3903.7470.0770.7201.526 S259.9235.0030.0280.9350.746 平均值7.2124.2300.0631.7161.483

3 讨论

本试验采用二极管阵列检测器，对木兰花碱对照品进行三维图谱分析，结果表明木兰花碱的最大吸收波长在283 nm处，为提高含量测定的检测灵敏度，选择283 nm作为检测波长。

试验流动相比较了有机相甲醇、乙腈及水相0.1%、0.5%甲酸水和冰醋酸水、磷酸水溶液，结果显示，以甲醇-0.1%甲酸水为流动相时，样品的分离达到要求。

为探讨样品提取的最优条件，本试验考察了液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1）、提取溶剂（50%、70%、90%甲醇和乙醇）、超声提取时间（30、45、60 min）对提取效果的影响。结果表明，溶剂为70%甲醇时木兰花碱提取率较高，由于生物碱的极性较强，有机溶剂比例较低时不利于其溶解，故50%甲醇提取较差；液料比10∶1、超声提取45 min条件下，色谱峰数目最多，峰面积较大，峰形较好。

本研究利用HPLC技术建立了不同产地单面针及两面针的指纹图谱，并对差异性成分木兰花碱进行定性定量分析。本方法分析速度快，35 min即可完成，灵敏度高，分离效果佳，能显示出样品中各成分的信息，较直观反映药材质量。方法学考察结果表明，本方法重复性好，可操作性强，可用于单面针及两面针药材特征指纹图谱的定性鉴别。结合二者共有生物碱含量测定结果，可确定单面针中化合物最低及最高限量，为单面针的含量测定提供依据。样品含量测定结果表明，单面针样品中S25（湖南省湘西州泸溪县）木兰花碱含量最高。由于存在地域水土、气候等影响因素，不同产地样品在化学成分含量上存在差异，推测药材生长于雨水较频繁的地区可能导致其化学成分含量低于雨水较少的地区。本试验收集的40批药材采收时期、生长年份不同，可能导致药材化学成分含量差异较大，很难仅凭某些成分或产地评价其质量。药材生长因素和药用部位对单面针化学成分的影响尚有待更多研究。

[1] 湖南食品药品监督管理局.湖南省中药材标准[M].长沙：湖南科学技术出版社,2009：48-49.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015.

[3] 全国中草药汇编组.全国中草药汇编：下册[M].北京：人民卫生出版社,1978：1586.

[4] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社,1999：987-988.

[5] 杨鹏,卿志星,向锋,等.HPLC-Q-TOF/MS法鉴定两面针和单面针中的生物碱[J].中成药,2017,39(8)：1646-1650.

[6] 陈铁寓,彭兴,龙盛京,等.二维红外相关光谱在两面针与单面针鉴别中的应用[J].现代仪器,2011,17(4)：36-38.

[7] 肖水平,詹济华,张雨林,等.单面针茎不同极性部位抗菌及对MCF-7细胞抑制活性的研究[J].天然产物研究与开发,2016,28(9)：1460-1463, 1469.

[8] 吴润菁,王欢,祝晨蔯,等.高效液相色谱法测定单面针中木兰花碱的含量[J].广州中医药大学学报,2014,31(3)：443-447.

[9] 韦熹苑,裴刚,袁园.单面针茎中氯化两面针碱和橙皮苷含量测定[J].中国现代药物应用,2014,8(3)：24-25.

[10] WORLEY B, HALOUSKA S, POWERS R. Utilities for quantifying separation in PCA/PLS-DA scores plots[J]. Analytical Biochemistry, 2013,433(2)：102.

Study on HPLC Fingerprint and Quality Standard of

LIU Qianqian1,2, LEI Simin1,2, HU Yuzhen1,2, XIA Bohou1,2, LIN Yan1,2, LIN Limei1,2,GONG Yun3, ZHANG Peng3, WU Ping1,2

To establish a quality-control method of, including establishment of characteristic fingerprint and determination of the contents of magnoflorine, moisture, total ash, acid insoluble ash and extract; To provide reference for distinguishingfrom.Fingerprints ofbased on HPLC method was established on a Waters Athena C18, 120A column (4.6 mm×250 mm, 5 µm) at 30 ℃, with a gradient mobile phase composed of methanol and 0.1% formic acid at a flow rate of 0.3 mL/min. The detection wavelength was 283 nm. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminate analysis were adopted to screen differential markers betweenand. The identification and determination of markers were carried out by comparing with real standard products. The contents of water, total ash, acid insoluble ash and extract were determined according to the general rule in four part of Chinese Pharmacopoeia (2015 edition).Characteristic fingerprints ofwere established. 11 mark compounds were found to distinguishand. Among which, magnoflorine was identified. The magnoflorine showed a good linear response in the range of 0.48‒5.76 μg (=1). The average of recovery was 97.23% with RSD=1.31%. The contents of magnoflorine in the samples ofwere 2.227 3‒21.027 2 mg/g, and the result of water, total ash, acid insoluble ash, water soluble extract and ethanol soluble extract ofwere 5.016%‒10.910%, 2.487%‒5.973%, 0.027%‒0.147%, 0.548%‒2.512% and 0.332%‒2.113%, respectively.The established method is simple, accurate and reproducible, and can be used to evaluate the quality of.

; HPLC; quality standard; magnoflorine