响应面法优化超声提取鸡血藤总黄酮

梁燕妮，刘平江，丘观玲

(1.2.3.梧州学院，广西 梧州 543002)

中药材鸡血藤(Millettiadielsiana)是豆科植物密花豆干燥的藤茎，又称血藤、血风藤、九层风等[1-3]。鸡血藤是传统的中药材，在历代的本草著作中均有记载[4]。鸡血藤作为桂药之一，在广西有着极大的生产量，在广东、云南、贵州等地也有种植[5]。鸡血藤中的主要活性成分为黄酮类物质[6-7]。临床试验证明，鸡血藤中的黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂等作用[8]。近年来，学者们对于鸡血藤的研究不断深入，但在提取鸡血藤中有效成分方面所取得的成果并不多。利用现代提取技术提取鸡血藤有效成分是现今研究的重点。本试验将通过超声提取技术对鸡血藤总黄酮进行提取，运用响应面法对鸡血藤总黄酮提取的工艺进行优化，并确定其最佳工艺。

1 材料与仪器

鸡血藤、芦丁标准品、亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠(试剂均为AR级)，752N型分光光度计、中药粉碎机、电子天平、SB-5200D型超声清洗机等。

2 试验方法

2.1 标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品10.00 mg，用体积分数40%的乙醇溶解，定容至50 mL，摇匀，即获得质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液。准确量取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于已编号码的10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min；加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀静置6 min；加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，摇匀，最后用30%乙醇定容至刻度，静置15 min。将波长调至510 nm处，测定各浓度吸光度值。以吸光度A为纵坐标、质量浓度C为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=9.918 6X-0.005 1，R2=0.999 5。线性关系良好。

2.2 鸡血藤总黄酮的提取

准确称取鸡血藤粉末0.25 g，加入50 mL三角瓶中，在一定条件下(料液比、超声时间、乙醇体积分数)进行超声提取，然后置于离心机内离心，取上清液测定吸光度[9]。根据标准曲线回归方程计算总黄酮含量，并计算总黄酮的提取率。

2.3 单因素试验

2.3.1 超声时间。准确称取鸡血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40加入体积分数为40%的乙醇。分别超声提取20，30，40，50，60，70 min，探讨超声时间对总黄酮提取率的影响。

2.3.2 料液比。准确称取鸡血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，加入体积分数为40%的乙醇溶液，超声提取40 min。研究料液比对总黄酮提取率的影响。

2.3.3 乙醇体积分数。称取鸡血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40分别加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，超声提取40 min。探讨乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

2.4 响应面试验

根据单因素试验结果，确定Box-Behnken设计的自变量，以总黄酮提取率为响应值，运用统计软件Design Expert 8.0.6，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平响应面分析方案，以确定最佳提取工艺参数。响应面试验设计见表1。

表1 响应面试验设计

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 超声时间对鸡血藤总黄酮提取率的影响。由图1可见，曲线呈现出先增后减的趋势，这表明总黄酮的提取率受到超声时间的影响，随超声时间的变化而变化。当超声时间为20～40 min时，总黄酮提取率随着超声时间的延长而增加；超声时间为40 min时，曲线达到最高点，此时提取率最高。此后，随着超声时间的延长，总黄酮提取率则逐渐缓慢降低。分析原因可能是由于超声波的作用使药粉细胞内的黄酮化合物逐渐溶出，在一定超声时间内，溶出量逐渐增加；但是超声时间过长，药粉中的黄酮类物质也会因超声作用分解，影响了总黄酮的提取率，提取率降低[10-11]。因此最适的超声时间考察范围为30～50 min。

图1 超声时间对总黄酮提取率的影响

3.1.2 料液比对鸡血藤总黄酮提取率的影响。由图2可见，当料液比为1∶20～1∶50时，提取率的大小随着料液比的增大而增加。料液比为1∶50时，提取率达到最大；继续增加料液比，总黄酮的提取率则缓慢下降。可能由于在一定量的粉末中，所含黄酮类物质是一定的，料液比的增加也只是增加了溶剂的量，当溶剂达到一定量时，溶入溶剂的黄酮类物质达到了平衡，不会随着料液比的增加而上升[12-13]；在此之后，继续增加料液比会增加杂质的溶出量，使总黄酮提取率反而变小。

图2 料液比对总黄酮提取率的影响

3.1.3 乙醇体积分数对鸡血藤总黄酮提取率的影响。由图3可见，当乙醇体积分数为20%～40%时，曲线呈现上升趋势，说明溶入溶剂中的黄酮类物质逐渐增加，提取率上升；当乙醇体积分数为40%时提取率达最大值。因溶剂乙醇的极性随着乙醇体积分数上升而增大，当乙醇体积分数为40%时，溶剂的极性与样品中黄酮类化合物的极性十分相似，黄酮类物质的溶出率最高，总黄酮的提取率也达到最大值；此后，继续增加乙醇体积分数，使极性增加，但总黄酮提取率反而降低，其原因可能是鸡血藤中所含有的糖类物质、脂溶性物质以及粘稠性的物质会在高体积分数的乙醇大量析出，从而对粉末中黄酮类物质的溶出造成影响，使总黄酮提取率下降[14]。因此，最适的乙醇体积分数考察范围为30%～50%。

图3 乙醇体积分数对总黄酮碍率的影响

3.2 响应面法优化提取工艺

3.2.1 响应面试验结果。根据单因素试验结果，以鸡血藤黄酮提取率为响应值，以超声时间、料液比、乙醇体积分数为自变量，进行响应面优化试验，结果见表2。

表2 Box-Behnken响应面试验结果

3.2.2 建立拟合回归模型方程。通过Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行多元回归拟合，得到响应面二次多项回归模型方程：

Y=6.23+0.054A+0.056B+0.10C-0.050AB+0.0025AC-0.057BC-0.16A2-0.016B2-0.18C2。

其中，A为超声时间，B为料液比，C为乙醇体积分数。

3.2.3 回归模型方差分析。根据表2的数据进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，模型P=0.000 1<0.01，表明该模型极显著。失拟项P=0.123 1>0.05，模型失拟项不显著，说明本试验无其他因素影响。模型的决定系数R2=0.973 3，说明此模型可以解释97.33%的响应值变化。该模型拟合度较好，试验误差小，可以使用此模型进行分析和预测超声辅助提取鸡血藤总黄酮提取率各因素的影响。

表3 回归模型方差分析

比较各F值可知，A、B、C3个因素对总黄酮提取率的影响由大到小排列如下：C>B>A；一次项中，A、B显著，C项极显著，交互项BC对总黄酮提取率的影响显著，AB、AC项不显著；模型纯误差的均方为1.02×103。由此可知，各因素对响应值的影响并不是简单的线性关系。

3.2.4 两因素交互作用对总黄酮提取率的影响。图4为超声时间与料液比的等高线及响应面图。等高线图反映出：总黄酮的提取率随着超声时间增加，表现出先增加后降低的趋势，料液比的改变对总黄酮提取率的影响也如此。当超声时间为40 min，料液比1∶50时，总黄酮的提取率达到最大值；比较料液比与超声时间变化曲面，料液比坡度较陡，表明出料液比对总黄酮提取率影响较大，此结果与回归方程的结果一致。在三维空间曲面图中，料液比轴向等高线稍密集，表明料液比对鸡血藤总黄酮提取率的影响较大；超声时间轴向等高线稍稀疏，说明超声时间对于提取率的影响较小。

图4 超声时间与料液比的等高线及响应面图

图5为超声时间与乙醇体积分数的等高线及响应面图。由图5可见，鸡血藤总黄酮提取率随着乙醇体积分数及超声时间的改变而表现出先增后降的趋势，但乙醇体积分数对提取率的影响较大；响应面三维图中，超声时间这一变化曲面坡度较缓，表明超声时间对于提取率的影响较小。

图5 超声时间与乙醇体积分数的等高线及响应面图

图6为料液比与乙醇体积分数的等高线及响应面图，由图6可见，乙醇体积分数对鸡血藤总黄酮的提取率影响较大。

图6 料液比与乙醇体积分数的等高线及响应面图

3.2.5 最佳工艺条件的预测与验证。将单因素试验所得出的结果，用响应面分析软件进行优化试验设计并进行试验；将试验结果输入软件中进行响应面分析，确定出超声辅助提取鸡血藤总黄酮的最佳提取条件。最优工艺参数为超声提取时间40.95 min、料液比1∶52.18、乙醇体积分数为40.45%，此条件下总黄酮提取率理论值为6.24%。考虑到实际试验操作的可行性，在对提取率影响不大的情况下，对提取工艺进行修正，修正后的工艺条件为超声时间41 min，料液比1∶52，乙醇体积分数41%。采用修正后的工艺条件进行3次验证试验，结果总黄酮提取率为6.19%，相对误差约为0.8%，说明所建立的数学模型具有较好的可靠性，响应面法优化鸡血藤总黄酮提取的工艺条件可行。

4 结论

对鸡血藤总黄酮的提取，一直是众多学者所研究的课题。近年来，作为现代提取技术之一的超声提取技术被广泛应用于中药材有效成分的提取中。为了提高鸡血藤药材中有效成分的提取率，本试验采用超声波辅助提取，响应面法优化提取工艺条件。先选择影响提取率较大的3个因素：超声时间、料液比、乙醇体积分数进行单因素试验；得到各单因素提取总黄酮的较优条件范围，将优化后的参数进行响应面分析，建立二次多元回归模型方程。利用回归方程，得到提取鸡血藤总黄酮的最佳工艺参数为超声时间40 min，料液比1∶52，乙醇体积分数41%，在此条件下实际测得鸡血藤总黄酮的提取率为6.19%。